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《姜黄素诱导结肠癌lovo细胞凋亡作用和机制探究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用和机制探究[摘要]目的:探讨姜黄素促人结肠癌LoVo细胞凋亡的生物学作用及其调控机制。方法:体外培养人结肠癌LoVo细胞,0〜20mg・L-1不同浓度姜黄素处理后,采用MTT比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用,利用透射电镜观察细胞的超微结构,采用PI单标流式细胞仪测定细胞周期分布,AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率;采用RT-PCR检测Bax,Bcl-2,Caspase-3,Bcl-xLmRNA表达水平。结果:MTT检测显示姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的生长、增殖,呈现浓度和时间效
2、应关系;透射电镜结果显示姜黄素能使LoVo细胞发生形态学改变,呈现典型凋亡细胞特征;流式细胞仪分析显示姜黄素能阻滞细胞周期于S期,诱导细胞发生凋亡。RT-PCR检测显示姜黄素可促进细胞中Bax,Caspase-3mRNA表达,抑制Bcl-2,Bcl-xLmRNA表达。结论:姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖并促进其凋亡,这种生物学效应可能与激活Bax表达、抑制Bcl-2和Bcl-xL表达而活化Caspase-3的信号通路有关。[关键词]姜黄素;结肠癌;LoVo;细胞凋亡结肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。随着人们生活习惯和饮食结构的
3、改变,我国结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。除了传统的手术、放疗与化疗外,由于天然药物的多成分、多靶点、多环节、多途径效应,使人们认识到'‘回归大自然”的重要性,植物源化合物的抗肿瘤研究已逐步成为临床抗肿瘤药物研究的热点。姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取的一种天然多酚,为姜黄的主要活性成分。在亚洲一些国家,姜黄素一直被广泛地用作治疗炎症、哮喘、肝功能紊乱等疾病的药物、食品着色剂和调味剂。此外,姜黄素还在许多肿瘤细胞中发挥着抗炎,抗氧化,抗肿瘤和化学预防作用[1-2]。许多体内外实验也证实姜黄素能抑制肿瘤生长,显著减少瘤体的数目,减轻多种致癌因素对
4、机体的损害[3-5]。由于姜黄素的药理作用十分广泛,其抗癌作用机制较为复杂,目前仍未完全阐明。本研究拟探讨姜黄素对结肠癌细胞株LoVo的增殖抑制和凋亡诱导作用机制,为进一步阐明姜黄素的抗肿瘤机制提供更多的实验依据。1材料1.1药物及试剂姜黄素(C1386-10g,Sigma公司进口分装,临用时以少量DMS0溶解,再加培养液稀释至所需浓度,其中DMS0的终浓度2.2透射电镜观察细胞超微结构用0〜20mg・L-1梯度浓度的姜黄素作用LoVo细胞24h后,用0.25%胰蛋白酶消化离心,以0.01mol•L-lPBS(pH7.3)清洗2遍,1000r・
5、minT离心,收集细胞,迅速加入3%戊二醛固定3ho用0.01mol•L-lPBS(pH7.3)浸洗3次,加2%琼脂使细胞成团凝固,于1%饿酸中固定2h。再用0.01mol•L-lPBS(pH7.3)充分浸洗2次,梯度丙酮(50%〜100%)逐级脱水,进入氧化丙烯。环氧树脂Epon812逐步浸透、包埋,最后在Epon812中于60°C下聚合48h。超薄切片机切片,醋酸双氧铀和柠檬铅双染后,透射电子显微镜下进行观察。2.3PI单标法检测细胞周期将0〜20mg・L-l梯度浓度姜黄素处理24h的LoVo细胞消化离心,收集各组细胞,用0.01mol•L
6、-lPBS(pH7.3)轻洗2次;1000r•min-1离心5min,弃上清,加入2niL盐水G,吹打悬浮细胞,缓慢加入6mL预冷的95%乙醇,冰浴30min,4°C固定4h;1000r•min-1离心固定的细胞5min,弃上清,加入0.01mol•L-lPBS(pH7.3)6mL混匀,1000r•min-1离心5min,弃上清;加入1.5mL0.01mol•L-lPBS(pH7.3)吹打均匀,重悬细胞,再加入1.5mL的PI染液,避光染色30min后,以1X106个/mL上样流式细胞仪,检测细胞周期分布。2.4AnnexinV-FITC和PI
7、双标检测细胞凋亡将0〜20mg・L-l梯度浓度姜黄素处理24h的LoVo细胞消化离心,收集各组细胞,用0.01mol•L-lPBS(pH7.3)轻洗2次;1000r•min-1离心5min,弃上清,用500nLIX膜联蛋白结合缓冲液重悬细胞,加入5nLAnnexinV-FITC避光染色10min,再加入10uLPI于室温下避光孵育5min;上流式细胞仪检测荧光强度,分析细胞凋亡百分率。2.5RT-PCR检测Bax,Bcl~2,Caspase-3,Bcl~xLmRNA表达水平将0〜20mg•L-1姜黄素处理24h的LoVo细胞消化离心,收集细胞,
8、选用AxyPrepTMMultisource总RNA小量制备试剂盒提取细胞总RNA,操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳和