丁酸钠诱导结肠癌lovo细胞凋亡及其对p53靶基因的调控

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1、丁酸钠诱导结肠癌Lovo细胞凋亡及其对p53靶基因的调控【摘要】目的观察丁酸钠对结肠癌Lovo细胞p53的三个重要靶基因，p21mol/L丁酸钠进行干预。用MTT法检测细胞增生，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期；AnnexinVFITC/PI双标记观察细胞凋亡；RTPCR和期。p21RNA和蛋白的表达增加，其中以Gadd45的表达变化最明显。结论2.5mmol/L以上浓度的丁酸钠以剂量和时间依赖的方式，抑制结肠癌Lovo细胞增生，诱导凋亡；丁酸钠参与结肠癌Lovo细胞周期的调控，2.5mmol/L以上浓度的丁酸钠可以引

2、起Lovo细胞的G2/M期阻滞；丁酸钠的上述作用可能与其调控Lovo细胞中p21butyrateonthethreemaintargetgenesofp53,includingp21oleculemechanismofitsinhibitingproliferationandinducingapoptosisofLovocoloncancercells.MethodsThecoloncancercelllineLovomol/L，2.5mmol/L，5.0mmol/L，10mmol/Lrespectively.MTTine

3、dbybothfloetryandAnnexinVFITC/PIdoubletagging.RTPCRandaybetheeffectassociatedbutyrate,cellapoptosis,p53targetgenes丁酸钠是膳食纤维在肠道厌氧菌作用下产生的一种四碳短链脂肪酸（丁酸）的钠盐。研究发现，它可以对许多体外培养的哺乳动物细胞产生多种生物学作用。本研究选择携带野生型p53基因的结肠癌Lovo细胞株为研究对象，通过分析丁酸钠对Lovo细胞p53基因的三个主要下游基因，即p21a公司产品）：用0.1MPB

4、S配制成0.4mol/L的储存液（pH=7.2），冰盒保存备用。AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒（BioVision公司产品），引物由上海博亚生物公司合成。P21l,加到96孔板内，每孔加入200μl。培养24h后，实验组分别加入1.25、2.5、5.0、10mmol/L丁酸钠，对照组分别加入等量PBS。每个浓度每个时间接种8个复孔。经丁酸钠处理12、24、48、72h后，每孔加入MTT20μl，继续培养4h后，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150μl，振荡10min后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，绘制细胞生

5、长曲线。1.3流式细胞仪分析细胞周期和凋亡收集不同浓度丁酸钠作用0、24、48和72h的Lovo细胞。调整细胞密度为1×106个/ml,加入碘化丙啶染色液，室温避光染色30min，FACSVantage流式细胞仪检测各组细胞DNA含量的变化。应用计算机细胞周期分析软件计算出各时相分布的百分比。1.4AnnexinⅤFITC/PI检测凋亡离心收集5×105个细胞后，悬浮于500μl的结合缓冲液中，加入5μl的AnnexinVFITC和5μl的PI，室温避光孵育5min，流式细胞仪分析。1.5RTPCR检测p21RNA的

6、表达按照产品说明书，分别提取经5mmol/L丁酸钠作用0、24和48h的Lovo细胞的总RNA，取5μgRNA进行逆转录反应合成cDNA。以βactin为内参照，分别取3μl模版进行PCR反应。p21mol/L丁酸钠作用0、24和48h的Lovo细胞的蛋白，取50μg蛋白上样，电泳40～60min，30mA电流转膜4h后，5%的脱脂牛奶封闭3～4h，加一抗，4℃过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1h，DAB显色。1.8统计学分析采用SPSS11.0软件对数据进行t检验分析，以P＜0.05判定为有统计学差异。2结果2.1细胞形态

7、学观察正常培养的Lovo细胞大多呈星状生长，表面有细长足突，细胞核大而亮，贴壁生长，见图1。丁酸钠作用后，细胞表面细长的足突回缩，细胞变成圆球状。随着丁酸钠浓度升高和作用时间延长，细胞逐渐脱壁、漂浮。图2为5mmol/L丁酸钠作用48h后的Lovo细胞。10mmol/L丁酸钠作用48h后，细胞脱壁、漂浮。2.2丁酸钠对Lovo细胞生长曲线的影响2.5、5和10mmol/L丁酸钠组，在加药后12、24、48和72h观察均显示出明显的生长抑制作用，与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01）（图3）。2.3丁酸钠对Lovo细胞周

8、期分布的影响随着丁酸钠浓度的升高，处于G2/M期的Lovo细胞比例逐渐增多，与对照组比较有显著性差异（P＜0.001），两两比较亦有显著性差异（表1）。表1不同浓度丁酸钠作用48h后Lovo细胞周期的分布#▲P＜0.001；△#P＜0.001；▲P＜0.0012.4流式细胞仪检测SubG1峰分析凋亡率2