GGNBP2调控小鼠精母细胞DNA双链断裂修复和组蛋白泛素化修饰的机制研究

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1、．．ａｊ．．ＧＧＮＢＰ２调控小鼠精母细胞ＤＮＡ双链断裂修复和组蛋白泛素１化修饰的机制研究ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＧＧＮＢＰ２ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＤＮＡ－ｓｄｏｕｂｌｅｔｒａｉｎｂｒｅａｋｒｅｐａｉｒａｎｄｈｉｓｔｏｎｅｕｂｉｕｉｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｑｍｏｕｓｅｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ作者姓名：郭凯敏专业名称？：外科学＇研究方向：男性生殖的基础与临床研究指导教师：王洪亮教授学位类别：医学博士培养单位一：吉林

2、大学白求恩第医院ｉ１论文答辩日期：年／月日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位‘主席金宁一教授军事医学科学院委员孙连坤教授吉林大学基础医学院李玉新教授东北师范大学生命科学学院王桂侠教授吉林大学白求恩第－医院刘建国教授吉林大学白求恩第－医院？孟样伟教授吉林大学白求恩第一医院未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复

3、制、、修改、发行、出租改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律贵任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声，：所呈交是本人在指导教师的指导下，明学位论文独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或机体已经发表或撰写过的作品成果，对本文的研究作出重要的个人和集体，均在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声。明的法律结果由本人承担学位论文作者签名：＼口期：年月曰中文摘要GGNB

4、P2调控小鼠精母细胞DNA双链断裂修复和组蛋白泛素化修饰的机制研究精子发生是一个极其复杂的细胞分化过程，主要包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。在这一复杂的过程中，涉及了多种基因调控和蛋白表达修饰变化，除了可以在转录水平研究基因表达的蛋白功能外，在蛋白水平研究蛋白质的翻译后修饰也具有重要意义。组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。这些翻译后修饰在染色质的结构重塑、基因的转录调控、DNA的损伤修复等生命过程中发挥着极其重要的作用。配子生成素结合蛋白2（

5、Gametogenetinbindingprotein2，GGNBP2），又称锌指蛋白403，是配子生成素（GGN）的结合蛋白，在睾丸组织中高表达，酵母双杂交实验证实GGNBP2能够与GGN1、GGNBP1以及OAZ3相互作用，在精子发生过程中起决定作用。我们前期工作发现Ggnbp2基因敲除引起雄性小鼠无精子症，生精过程阻滞于精子细胞，生精上皮管腔完整性破坏，精子顶体、核仁畸形。本课题拟在此基础上，体内外实验进一步研究GGNBP2和GGN1（GGN蛋白最大异构体）在精母细胞减数分裂，DNA双链断裂修复

6、中作用，以及GGNBP2在调控组蛋白翻译后修饰的分子机制。研究结果如下：（1）相互免疫共沉淀证实GGNBP2与GGN1互作，两种蛋白共同定位于小鼠精母细胞和精子细胞（Golgiphase，Capphase）细胞核和胞浆，精子细胞（Acrosomephase，Maturationphases）顶体和尾部，GGNBP2缺失引起幼龄和成年小鼠睾丸组织GgnmRNA水平和蛋白水平减低，免疫荧光显示GGN1表达更加局限于细胞核，胞浆染色荧光强度显著减弱。流式细胞术和RT-PCR显示基因敲除组睾丸生殖细胞单倍体细

7、胞数量减少，而四倍体细胞数量增加。（2）成功构建Ggnbp2和Ggn基因敲除的体外精母细胞（GC-2spd），XTT和流式细胞术显示Ggnbp2和Ggn基因敲除在32℃条件下能抑制GC-2spd细胞增殖和分化，37℃条I件下对细胞增殖无影响，但仍能抑制精母细胞分化为单倍体细胞。Ggnbp2基因敲除降低GgnmRNA和蛋白表达。过表达Ggnbp2能恢复Ggnbp2KO细胞Ggn基因和蛋白的水平，也能部分恢复分化功能，而对GgnKO细胞的分化功能无影响。（3）免疫共沉淀显示GGNBP2能与DNA修复蛋白F

8、ANCL、RAD51、RAD18相互作用。Ggnbp2基因敲除不影响联会复合体（SYCP3/SYCP1）染色改变，而粗线期和双线期精母细胞-H2AX弥散分布于所有染色体，而不局限于XY小体上；RAD51在XY小体染色无明显差异，而常染色体染色荧光点显著增加；RAD18除XY小体外，其他部位均可见点状表达，而BRCC36foci显著增加。（4）体内外实验均显示Ggnbp2基因敲除上调组蛋白H2AK119泛素化水平。免疫共沉淀实验显示GGNBP2与多梳蛋白