泛素化修饰组学研究昼夜节律的调控机制

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1、泛素化修饰组学研究昼夜节律的调控机制题目:UbiquitylationDynamicsoftheClockCellProteomeandTIMELESSduringaCircadianCycle泛素化修饰组学研究昼夜节律调控机制期刊：CellReports影响因子：&032主要技术：泛素化修饰组学研究背景：昼夜节律机制帮助生物个体调整其生理功能以适应外界环境的变化。早期的机制研究多集屮在转录调控机制基础Z上，随着研究的深入，蛋白水平调控，特别是各种翻译后修饰,如泛素化，对昼夜节律的调控同样起到了重要作用。研究结果1.泛素化蛋白质组学鉴定昼夜节律相关蛋白作者利用

2、基于泛素化修饰蛋白质组学的方法，对处于不同时间节点的果蝇头部样木进行泛素化labelfree质谱检测分析，每组样本包含三个生物学重复。果蝇头部提取物中的时钟蛋白质主要来源于视网膜，视网膜具有自己的吋钟基因，而恒定黑暗中的运动活动节律很大程度上取决于脑时钟网络的小侧腹神经元（sLNv）振荡器。因此，作者将tim+clock细胞的泛素化组学数据与胚胎神经细胞和成人光感受器的两个泛素化组学数据集进行了比较，发现在光感受器和时钟细胞屮同时存在91种泛素化蛋口（图lD）o在不同的时间节点Z间的泛素化修饰的差异蛋白有52个（图1E）,在这些差异蛋白中，一个核孔复合物蛋白M

3、TOR的丰度变化随着时问的变化尤其显著（图1F）。一般情况下泛素化蛋白丰度的倍数变化集屮在2倍以下（图1G）,这与哺乳动物肝脏中总蛋白水平的昼夜节律相似。作者对52个候选蛋白进行分析，发现泛素化蛋白质不均匀相分布，大多数在CT6达到峰值（n=43）＜,因此，作者认为，时钟细胞中的蛋白质泛素化集中在白天，而昼夜节律控制的蛋白质合成主要集屮于CT7（中午）和CT19（午夜），以双峰方式呈现。NeutrAvidineluates■•-■■4!・061218061218tjm>bfoub225kDa150kDaPERCTc88BirACT183530252015105

4、AouenbalJ211CTtim>0BirAe/av*embryo78116225123tim^adulthead186bioUb->130kDa-PCB-50-130kDaNeutrAvbdinCT6CTO2OTCSSasuooJdjoJeqEnu11.522.53foldchange(Iog2)>130kDa<130kOa泛素化蛋口质组学鉴定昼夜节律相关蛋口1.MTOR蛋白节律泛素化为了验证组学结果，作者选择了儿个候选蛋白进行WB验证实验。结果表明，有四个候选蛋白（HSP83,NRV2,MTOR和SGG）显示出可识别的泛素化，但是只有纯化的bioUb样品

5、的MTOR免疫印迹结果表现出泛素化节律性（图2A和2B）。为了控制总蛋白水平的可能节律性，作者选择抗MTOR印迹果蝇头部裂解物，发现蛋白质水平没有明显变化（图20,这表明MTOR的泛素化程度是受到调控的。MT0R是与NUP153形成核篮的最内核孔蛋白,它参与细胞分裂的控制并在染色质调节中发挥作用。为了研究这种调控对节律的影响，作者利用RNAi的技术敲除MTOR,发现敲除导致行为周期延长并降低节律性的幅度（图2D）。AUb-MTORMTOR225kDaCT61218018tim>bioUbbioUbbirAInputNeutrAvidineluatewClk-G

6、AL4/Y;;UAS-Dcr^wMepunqB—150kDa36912151821MTOROGT—225kDawClk・GAL4/Y;MtorRNAiKK102690/+;UAS-Dcr^t=25.2wClk・GAL4/Y;;UAS・Dcr・2/MtorRNAiHMS00735r=26.5t=23.5DDII0EH111UHill15CTCT012JIIIUIIIIIMIBlIIH【IHINIBIMIIJINIBIBICBIINIIHIItllIIIBIIHIB：IlMlUUI则Hlnun:inini••uniIMIIIB012MHCTIMPER图2MTOR的

7、节奏泛素化1.MTOR的泛素化影响昼夜节律的分子机制MTOR作为核孔蛋白促使作者研究了MtorRNAi蝇的sLNv屮PER、TIM的亚细胞定位和在不同吋I'可节点的蛋白水平，来探究其影响昼夜节律的分子机制。PER和TIM通常从CT18开始经历由精细调节的细胞质到核的转变，以实现它们作为转录抑制因子的作用。与野生型相比，TIM和PER在MtorRNAisLNvs的两个时间点显示出更多的细胞质定位（图3）,表明这些蛋白质的核定位缺陷可能导致行为期延长。午夜时分，TIM和PER的表达水平有非常显MTOR通过影响下游TIM及PER箸的提升，早上TIM和PER的降解速度

8、也变慢。综上表明,蛋白的泄位及泛素化水