针对禽白血病病毒整合酶的抗病毒机制及泛素化修饰研究

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1、分类号：单位代码：密级：学号：博士毕业论文针对禽白血病病毒整合酶的抗病毒机制及泛素化修饰研究研究生：王占新指导教师：唐军教授申请学位门类级别：农学博士专业名称：基础兽医学研究方向：动物生物化学与分子生物学所在学院：动物医学院Ph.D.DissertationStudiesofhostantiviralmechanismandubiquitinmodiflcationonbasedonavainleukosisvirusintegrasePh.D.Candidate:ZhanxinWangSupervisor:Prof.

2、JunTangMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchfield:AnimalBiochemistryandMolecularBiologyChinaAgriculturalUniversityMay,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中己经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机勾的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所

3、做的任何贡献均已生论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年月义日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）摘要禽白血病病毒，属于反转录病毒属成员，能引起鸡发生肿瘤性疾病，近些年来，

4、亚型在我国鸡群中广泛传播，给养鸡业造成了巨大经济损失。然而到前为止，对的感染还没有有效的商品化疫苗和治疗措施。反转录病毐复制过程中重要的限速步骤是将病毒逆转录的整合到宿主基因组中，而催化这一过程的关键性酶便是整合酶。已有研究表明，整合酶除具有整合功能外，还能参与病毒的脱衣壳、反转录、病毒蛋白的表达、病毒粒子的包装等过程，而要完成如此众多的生物学功能，必需要有宿主蛋白的参与。然而关于整合酶与宿主蛋相互作用的研究报道非常少。基于此，本论文筛选了与整合酶相瓦作用的宿主蛋白并研究了其分子机制，为全面揭示和宿细胞的相互作用及防控

5、该疾病策略的制定奠定基础。本实验首先通过酵母双杂交技术，以的整合酶为“诱饵蛋白”从鸡法氏囊文库中筛选到了与其相互作用的宿主蛋白；随后，利用免疫共沉淀技术在人细胞中证明过表达的和可以发生蛋白间相互作用。通过内源性免疫共沉淀证明了在鸡细胞屮过表达的能够结合细胞内源的同时也证明了在感染时可以结合内源性的通过实验证实了能够与直接结合，并通过其端介导与的结合，结合位置是的催化中心；激光共聚焦技术证明了和共表达时存在共定位。在病毒复制实验中，发现当细胞过表达后，细胞以及细胞上清液屮病毒量明显低于对照组；而沉默时，细胞以及细胞上清液

6、巾病毒量则高于对照组。这说明能有效抑制病毒复制；为了进一步确定内源性对病毒复制的抑制作用，我们沉默后感染病毒，不同时间提取细胞基因组，检测整合入宿主基因组巾病毒水平，结果发现沉默后整合在宿主基因组中病毒含量显著增加。蛋白质泛素化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰，它参与众多细胞内生物学过程。本实验通过对多种病毒蛋白进行泛素化检测，结果发现的、和蛋白可以发生泛素化修饰。鉴于在该病毒复制过程巾的重要作用，我们以作为研究对象进一步研究，发现的催化中心是其发生泛素化修饰的主要结构域，并且这一泛素化修饰不依赖于赖氨酸残基；相同

7、现象我们在另一反转录病毒的上也得到证实；进一步研究发现，的锌指结构会影响其泛素化水平；经鉴定，和是其发生泛素化修饰的位点。综上所述，我们筛选到了一种能与相互作用的宿主蛋白对其功能研究发现可以通过其端直接与催化中心结合，从而影响了病毒在宿主基因组的整合，并最终抑制了病毒粒子的产生。我们的研究结果衣明宿主蛋白可苴接靶向反转录病毒整合酶并抑制病毒的复制，为治疗反转录病毒提供了新思路；同吋，我们发现能够发生不依赖于赖氨酸残基的泛素化修饰，这种修饰如何影响病毒活性和病毒复制，以及发生泛素化修饰时所需要的泛素结合酶和泛素连接酶还需

8、要进一步的研究。关键词：禽白血病病毒，整合酶，抗病毒机制，泛素化修饰AbstractAvianleukosisvirus(ALV),whichbelongstothefamilyRetroviridae,inducesneoplasmsinchickenandleadstosevereeconomiclossesinthepoul