突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究

突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究

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时间:2019-09-25

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1、突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究摘要从突变的冬虫夏草中可大量提取出一种水溶性多糖(命名为MCMP),通过热水提取,利用sevage法、乙醇沉淀,阴离子交换和凝胶过滤层析CL-6B法脱除蛋白质。该多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成,它们的摩尔比为59.36:1:8.31:39.50,其平均分子量为8100。在这项研究中,我们选择喉癌Hep-G2细胞,Hela细胞和肾小球系膜细胞来研究该多糖的抗肿瘤活性。MTT测定结果表明,经48小时的培养后,该突变体菌株的多糖对细胞增殖有抑制作用。引言冬虫夏草,最昂贵的中国传统药物之一

2、,被认为是中国罕见的虫草。冬虫夏草具有广泛的药理活性,包括抗炎,镇痛抗氧化,抗血栓生成,常用于补肾、缓解肺部炎症,治疗高血糖,高血脂,肾功能不全和肝脏疾病等。现代医学研究表明,冬虫夏草对人体的几个系统有益,如循环系统、免疫、造血、心血管、呼吸和腺体系统。然而,时下,冬虫夏草的过度开发导致了野生冬虫夏草的灭绝及土地的荒漠化。培育虫草,而不是传统的恢复冬虫夏草是人们迫切需要的。在中国及东南亚,一般将培育子实体作为原料药和保健食品进行售卖。近年来,科学家们对它的生命周期进行了广泛研究,以期分离出发酵菌株。从天然冬虫夏草中已分离出几株。木耳栽培技术已被

3、用于培育冬虫夏草,它们显示出类似的药理活性,冬虫夏草可以生产多种生物活性成分如虫草素,D-甘露醇和某些多糖。多糖因其多种多样的生物活性而备受关注,它被广泛地应用在化妆品,药品,食品营养等行业。研究发现,某些多糖对包膜病毒有抵抗功效,包括HSV-1病毒,流感病毒和人巨噬细胞病毒,而且具有抗肿瘤活性。冬虫夏草具有多种类型的多糖,已报道它们具有许多令人关注的生物活性,包括免疫刺激,抗肿瘤活性和自由基清除等。中国吉林大学普通生物学中心实验室研究发现,突变冬虫夏草(H4019)高产多糖达0.780g/L。因此,本研究的目的是对冬虫夏草H4019的多糖进行

4、分离,纯化,表征及抗肿瘤潜能的探究。2.材料和方法2.1药品a.琼脂糖凝胶CL-6B是从PharmaciaBiotech公司购得。b.DEAE-52纤维素阴离子交换柱是来自AmershamBiosciences公司。三氟乙酸(TFA)购自Merck公司。c.3-(4,5-二甲基-2-基)-2,5-二苯基溴化(MTT),刀豆蛋白A(刀豆)和脂多糖(LPS)购自Sigma化学公司。d.作为介质的RPMI-1640培养基购自GIBCOInvitrogen公司。RMPI-1640培养基,用于免疫学实验,配有HEPES缓冲液10μmol/ml,青霉素10

5、0IU/mL,链霉素100g/ml,L-谷氨酰胺2mol/ml,2-巯基乙醇50mol/L,10%的新生牛血清,pH=7.2。a.所有其他试剂均为可用的最高品质。2.2细菌培养将原始菌株(CGMCC5.699)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上,26℃下培育7天,然后在液体培养基中激活4天诱导出高产突变冬虫夏草(H4019)。种子菌液与浸没液以4%的比例接种到发酵液中,得到真菌菌丝。真菌菌丝体冷冻干燥并收集。用蒽酮-硫酸法以葡萄糖为标准确定总碳水化合物含量。2.3MCMP的提取从冬虫夏草中获得的真菌菌丝体,在沸水浴中加热3.5小时,并用4

6、层纱布过滤。将固体物质在相同条件下萃取两次。合并滤液并离心除去不溶于水的物质。离心(8000r/min,10min)后,将上清液浓缩至1000mL,加入95%(体积分数)乙醇。乙醇最终体积分数为80%。悬浮液在3000r/min下离心10min后,收集沉淀物,并将其冷冻干燥,得到粗多糖级分。碳水化合物总含量测定。将多糖重新溶解在1000ml蒸馏水中,用Sevag法(试剂V正丁醇:V氯仿=1:4,250ml)处理,将其在5000r/min下离心15min以除去蛋白质。Thesupernatantwasdialyzedagainstdeionize

7、dwaterovernightbeforeconcentrationinavacuumevaporatorat55°C.将上清液透析去离子水中过夜,用真空蒸发器在55℃下进行浓缩。将乙醇与样品以4:1(体积比)进行沉淀,并除去沉淀和溶剂乙醇后,得到冬虫夏草(MCMP)的菌丝体脱蛋白的多糖级分。总碳水化合物的含量确定了。2.4MCMP的纯化将20mgMCMP溶解在1ml的蒸馏水中,用DEAE-52纤维素阴离子交换柱(2.6厘米×60公分)进行离子交换。该柱先用去离子水,然后再用梯度溶液(0.1,0.2和0.3mol/L的NaCl)分别以0.5ml

8、/min的流速进行洗脱。收集级分(5毫升,每份),根据蒽酮-硫酸法确定总碳水化合物含量。糖醛酸的含量用m-羟基法确定。得到的级分浓缩,用蒸馏水透析,然

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