夹竹桃多糖分离、纯化及抗肿瘤活性的研究

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1、福建师范大学硕士学位论文夹竹桃多糖分离、纯化及抗肿瘤活性的研究姓名：吴建璋申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：肖义军20090601中文摘要目的：本文研究夹竹桃多糖的分离、纯化方法，抗肿瘤效果及其作用机制。方法：采用水提醇沉法从夹竹桃叶提取粗多糖(NP)，NP经过DEAE-SephadexA-25分级，SephadexG一100纯化后得纯多糖(NP3、NP4)，分别对其纯度和部分理化性质进行鉴定。研究NP体内对小鼠S180皮下移植瘤和S180腹水瘤生长的抑制作用，采用免疫组化法检测皮下移植瘤细胞中的PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表达，采用药物

2、相互作用指数研究了NP与环磷酰胺联用对S180皮下移植瘤抑制的协同作用。研究NP对正常小鼠巨噬细胞碳廓清能力、免疫器官指数和腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响，检测NP对ConA和LPS分别诱导正常小鼠脾脏T、B淋巴细胞的增殖影响。应用MTT法研究纯化后的多糖NP3、NP4分别对K562细胞增殖的抑制效果，细胞集落培养观察NP3、NP4分别对K562中增殖细胞群的影响。结果：经提取得到的NP为淡黄色粉末状物质，得率为3．95％，NP的多糖含量为81．14％，NP经分离纯化后得两个多糖组分NP3和NP4。NP对小鼠S180移植瘤有明显的抑制作用并且能显著延长腹水

3、瘤小鼠的寿命，NP作用后移植瘤组织中表达PCNA、Bcl-2蛋白的细胞阳性率明显降低，表达Bax蛋白的细胞阳性率明显升高，NP100mg／kg与CTX10mg／kg组联用具有协同作用。NP能显著增强正常小鼠巨噬细胞的碳廓清能力，明显提高胸腺及脾的脏器指数，显著增强腹腔巨噬细胞吞噬活性，明显促进ConA和LPS分别诱导的小鼠脾脏T、B淋巴细胞的增殖能力。NP3、NP4在体外明显抑制K562细胞增殖。结论：NP体内给药对S180荷瘤小鼠的抑瘤效果显著，能显著增强正常小鼠的免疫活性，NP3和NP4在体外均能有效抑制K562细胞增殖。关键词：夹竹桃：多糖；S1

4、80；抑瘤作用；免疫组化；免疫；K562：增殖中文文摘多糖不仅能有效激活免疫细胞的活性、提高机体的免疫能力，而且对宿主正常细胞没有直接的毒副作用，因此被认为是一种重要的生物效应调节剂。近年来，来源于生物材料的多糖作为生物免疫调节物质是当今世界的研究热点。本论文主要研究了夹竹桃(Ne“姗inc／YcumMill．)多糖的提取、分离、纯化、部分理化性质、抗肿瘤效果及其作用机制。本文的主要工作和研究结果如下：1．经过热水浸提得到的夹竹桃多糖提取液经过三氯乙酸法和Sevag法去蛋白、流水透析去除小分子物质、乙醇沉淀、离心分离多糖、无水乙醇洗涤、冷冻干燥步骤初步

5、得到夹竹桃粗多糖(NeriumindicumMill．polysaccharides，简称为NP)，为淡黄色粉术，得率为3．95％，苯酚一硫酸法测定，提取物中多糖的总糖含量为81．14％。经过对预试验的结果分析后，以DEAE-SephadexA一25为固定相，用0．4mol／LNaCl溶液对NP进行洗脱，收集20管以后改用1．0mol／LNaCl溶液梯度洗脱，流速1mL／min，自动部分收集器收集，每管收集5mL，共收集20管，洗脱液用苯酚一硫酸法跟踪检测糖峰出现，得两个主要级分NPl和NP2。NPI禾INP2分别经过SephadexG一100凝胶层析

6、柱进一步纯化，均用蒸馏水进行洗脱，流速1mL／min，自动部分收集器收集，每管收集5mL，分别收集20管，洗脱液用苯酚一硫酸法跟踪检测糖峰出现，得两个主要级分NP3矛NNP4。采用苯酚一硫酸反应、硫酸一葸酮反应、茚三酮反应、碘一碘化钾反应对NP3年DNP4进行了部分理化性质的鉴定，结果苯酚一硫酸反应、硫酸一葸酮反应呈阳性，说明两者均具有多糖的一般性质：硫酸一咔唑反应呈阳性，说明两者均含有糖醛酸；茚三酮反应、碘一碘化钾反应呈阴性，说明两者均不含蛋白质和淀粉。采用SephadexG-100凝胶柱对NP3和NP4纯度进行了鉴定，结果均为单一主峰，说明二者均已

7、经达到层析纯：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对NP3和NP4纯度进行了鉴定，结果两种多糖在聚丙烯酰胺电泳的分离胶上均呈单一条带，证明NP3署I]NP4均为分子量均一的多糖，已达到了电泳纯。对NP3禾NNP4进行了紫外光谱(UV)分析，UV结果显示NP3和NP4在260nm矛D280nm处均无吸收峰，说明不含核酸和蛋白质。2．根据药物的溶解度和预实验确定了给药的剂量和梯度。在昆明小鼠右侧腋下接种S180腹水瘤，随机分组，腹腔注射分别给予50、100、150mg／kg的NP，阴性对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予等量环磷酰胺(CTX20mg／kg)，观察NP

8、IV中文文摘对小鼠S180实体瘤生长的抑制作用。结果显示，NP的50、100、150mg／l(