高亲和力抗体制备

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1、上海师范丸学卖验报告专业、年级生物科学班级久物科学姓名李晓娇学号110153274课程名称免疫学实验名称兔抗蛋口质H高亲和力抗体制备实验FI期实验目的通过实验获得兔抗蛋白质H的高亲和力抗体，学会制备抗体的方法。基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得和应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较人影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。材料（一）动物：健康雄性家兔2只（二）器材:剪刀、蹑子、注射器（2ml、50ml）附针头（9

2、号、6号）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。（三）试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG（10mg/ml）；3.消毒酒精及碘酒；4.弟氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA-IgG）的制备：吸2mlFCA于研钵中，逐滴加入1mg/ml纯化人IgG1ml,边滴入边研磨肓至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。7.弗氏不完全佐剂乳化抗原（FIA-IgG）的制备：吸2nilFIA于研钵中

3、，逐滴加入lmg/ml纯化人IgG1ml,边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，収1滴滴于冷水面上不散开为合格。免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.笫一次免疫：用2ml注射器吸取死氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）下称FCA-IgG）液1ml,每侧脚掌皮下各注入0.5mlo3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧胭窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG,每个淋巴结注0.1ml,其余注入淋巴结附近皮下共lml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧胭窝及鼠蹊部皮下。1.间

4、隔10天后，从耳静脉采血0.5〜1.0ml,分离血清，以双相琼脂扩散试验测定兔抗蛋口质H抗体的效价（即试血）。效价至少应达到1:16以上时才能放血。2.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也町在第2次免疫后，以引；氏不完全佐剂（FIA）乳化的抗原（人IgG）（简称FIA-IgG）再免疫1・2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。首次注射后一周

5、或稍长时间再次进行加强注射，可大人增强免疫应答。对免疫原性弱的抗原，需要多次注射（注射5-6次），可以在适当的时间间隔内，冇效的控制抗体效价的增加。放血颈动脉放血将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中耍严格按无菌要求进行。分离血清将三角烧瓶的血置37°C温箱1小时，再置4°C冰箱内3〜4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血淸。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂（0.01%硫柳汞或0.02%叠氮钠，最终浓度），分装后置4°C冰箱中保存备用。结果鉴定效价的

6、测定——双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否冇抗体及其浓度。琼脂板的制备：100mlpH7.1的磷酸盐缓冲液加到1.5g的琼脂内，于水浴屮加温，搅拌,使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65°C左右时，加入叠氮钠（NaN3）,使其在溶液屮的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固示，用打孔器打孔。屮央孔内加适量抗原（容量为5（）卩1）,周囤各孔内分别加入5（）□11：2、1：4、1：8、1：16、1：3

7、2及不稀释的抗血清，37°C下孵育24h,观察冇无沉淀线产生以判断血清的稀释度。注意事项1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较人，因此免疫时至少应选用两貝以上动物。另外，不能使用妊娠动物。2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H・81微空振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡（频率2900转/分，振幅6mm）；示者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合示，吸入注射器内再将注射

8、器连接于三腔管上反复抽吸研辭。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。3.佐剂一方面可提高特显性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物（0.005mgN）产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤具是豚鼠，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射吋应减少佐剂中BCG