抗体制备技术

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1、抗体制备技术1、多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物～。2、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）脾B细胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤细胞HAT培养，稀释单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图杂交瘤细胞

2、+PEG,融合Ab2抗体制备技术一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的纯化（四）免疫血清的鉴定（五）免疫血清的二、单克隆抗体制备（一）单克隆抗体制备原理抗体制备技术（二）单克隆抗体制备的技术要点（三）影响杂交瘤技术的因素（四）单克隆抗体的应用三、基因工程抗体技术（一）人源化抗体（二）小分子抗体（三）双特异性抗体（四）抗体库技术一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工或合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原

3、；具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原性抗原和免疫佐剂～1、细胞性抗原制备：绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）2、可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化～1）细胞的破碎（物理法、化学法）2）提取与纯化：①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境～例50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%～12%PEG6000可沉淀IgG～。盐析法沉淀抗原的机理③超滤法—利用孔

4、径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛～④层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提～⑤电泳——（略）3）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。凝胶过滤层析(分子筛)的作用机理亲和层析的作用机理3）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等）分子的质量—电泳、质谱蛋白的纯度—电泳、高效液相层析免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹抗原性质分析结果500007500010000012345Westernblot鉴定三株单抗的特异性1.分子量标准；2.阴性对照:正常小鼠血清；3.

5、纯化后的B6与病毒上清反应；4.纯化后的G12与病毒上清反应；5.纯化后的2B12与病毒上清反应。3、半抗原性免疫原的制备半抗原（hapten）～蛋白质等载体（carrier）～连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分子上4、免疫佐剂（immunoadjuvant），佐剂指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。种类—无机、生物性、人工合成、油剂和纳米颗粒。用途—抗原表面积增，构型改变；延长抗原的滞留时间；增强吞噬～（二）免疫动物1、免疫动物的选择：①抗原来源与动物种属的

6、关系（越近越差）②动物个体的选择（年龄、体重与健康，）③抗原性质与动物种类2、免疫的方法：免疫原的剂量～免疫的途径与其间隔时间～免疫动物采血～（对实验成功与否至关重要）（（三）免疫血清的纯化1、特异性抗体的纯化1）亲和层析2）吸附2、IgG类抗体的纯化1）盐析2）凝胶过滤3）离子交换4）亲和层析在凝胶过滤柱（sephadexG-200）上血清蛋白的层析示意(M=IgM,G=IgG,A=IgA)在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA)亲和层析纯化IgG基本过程示意图(四)免疫血清的鉴定1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（

7、免疫印迹、双扩散）3、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非竞争）结合等。单抗亲合常数的测定：单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：1）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；2）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为OD-100，找出OD-50时的抗体浓度和相应的pp65抗原浓度；3)根据公式Ka=n-1计算McAb的Ka值。2(n[Ab’]