克隆抗体制备技术(I)

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1、单克隆抗体制备平台建立尹芝南美国耶鲁大学医学院副教授南开大学生命科学学院院长基本概念抗原决定镞（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体Antigenicdeterminant是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团Polyclonalantibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体Monoclonalantibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体Ab1Ab3Ab4单克隆抗体抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）

2、脾B细胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤细胞HAT培养，稀释单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图杂交瘤细胞+PEG,融合Ab2杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（

3、A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)脾抗原免疫的脾细胞(B细胞)小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)1.抗体分秘(IgG+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生长2.8AG筛选出HGPTP-株PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞免疫动物培

4、养骨髓瘤细胞收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞细胞融合HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞检测筛选阳性细胞克隆化培养（反复3-5次）获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）McAb纯化及鉴定制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫2骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备3细胞融合4抗体检测5杂交瘤的克隆化和冻存6McAB的制备7单克隆抗体的纯化免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐

5、剂，可反复多次)冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2／0、X63等。保存：

6、防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％融合比例脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞一般在融合前一天制备免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后,改用一般培养液一般在杂交瘤细胞布满孔

7、底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗纯化方法：盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法用中性盐使蛋白质沉淀析出

8、的方法为盐析。大量的盐加