单克隆抗体(mcab)制备技术

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1、单克隆抗体(McAb)制备技术 1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克 隆抗体(monoclonalantibody,McAb) 获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命” ，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学 、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原Mc Ab的制备为例，介绍McAb的制备技术。 一、材料和方法(一)材料1PRMI1640培养液PRMI1640培养基粉

2、104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压 蒸气灭菌，每瓶80ml分装。 2完全PRMI1640培养液PRMI1640培养液80ml,1mol/LHepes2ml,02mol/L谷 氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。 3次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸 馏水加至100ml。 在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。 4氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176m

3、g，蒸馏水90ml，1mol/LNaOH05ml，加蒸 馏 水至100ml，再加05ml1mol/LHCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃ 中保存。 5HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml 。用5%NaHCO3调整pH值至74左右。 6HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值 至74左右。 750%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在

4、试管内加盖，1213℃高压蒸气灭菌 20min。 使用前加入等量的pH值82无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。 88氮杂鸟嘌呤称取8氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/LNaOH10ml或036%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。 9台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS100ml中即成。 10034mol/L蔗糖溶液蔗糖58g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。 (二)方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例) 1动物免疫将提取的空肠弯曲

5、菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐剂乳化，以皮下多点 及腹腔注射途径对8周龄左右的BALB/c小鼠(雌雄不限)进行基础免疫，间隔14天后，改为福 氏不完全佐剂，追加免疫，14天后再免疫一次，于融合前3天，经尾静脉用水剂抗原加强免 疫一次。每次抗原用量为每只鼠25～50μg。 2细胞悬液的制备 (1)骨髓瘤细胞：在进行细胞融合前的48h，用含10%小牛血清1640培养液， 将供融合用的骨髓瘤细胞(NS1或SP2/0)作增殖培养。融合前24h再以同样培养液将骨髓瘤 细胞培养物 换液1次，使细胞浓度于融合当天达到对数生长期的

6、105细胞/ml，取数瓶骨髓瘤细胞，轻 轻倒去瓶内原有培养液，加入无血清1640培养液少许，用毛细管吹打瓶壁数次，将细胞洗下 (如用冷的1640培养液冲洗瓶壁细胞更容易洗下)。将骨髓瘤细胞悬液一并收入离心瓶中，悬 浮于1640培养液中，轻轻混匀，吸出少量培养液进行细胞计数，并用台盼蓝染色观察死活细 胞率，成活细胞应高于90%。细胞悬液以1000r/min离心10min，倾去上清液，再悬于 无血清的1640培养液中供融合用。 (2)免疫小鼠脾细胞：取上述加强免疫后3～4天的小鼠，挖去眼球放血，收 集血液，离析血 清，供检测

7、抗体效价用。然后拉颈处死，用75%酒精将小鼠浸泡消毒，立即放超净台内，用 消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。用pH值74无血清1640培养液将脾脏冲洗，立即用镊子 将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内，然后倒入少量1640培养液，用5ml针筒芯子研 磨脾脏使成浆状，将此吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置5～10min，待大块脾组织下 沉到底部，轻轻吸出上层脾细胞悬液，移入另一刻度离心管内，悬浮于30ml1640培养液中 。轻轻混匀，吸取少量溶液，进行细胞计数及活力检查，活细胞率不应低于90%。以1000 r/min离心10

8、min，倒去上清，将底层脾细胞再悬浮于少量无血清1640培养液中。 取脾细胞的方法，除了在铜网上研磨外，还可用两个注射针头轻轻向一个方向将细胞从脾膜 内梳刮下来，或在脾包膜上刺几个孔，然后用针头注入培养液，将细胞冲洗出来；或用剪刀 反复将脾脏剪碎，以获得脾细胞