单克隆抗体制备标准化操作方案(mcab-sop)

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1、单克隆抗体制备标准化操作方案（McAb-sop）上海领潮生物科技有限公司第一章:小鼠免疫第二章：细胞融合第三章:细胞建株第四章:细胞株鉴定第五章:腹水制备第六章:抗体纯化和鉴定（略）第一章.小鼠免疫（BALB/c）小鼠免疫是单抗制备的关键一环，质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下：1•短程免疫方案：第一次：Id100ug（可溶性Ag）+等体积完全佐剂.腹腔注射.0.4ml/只第二次：7d100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射.0.4ml/只第三次：12d50ugIV（静脉注射）0.

2、3m"只（强化）第四次：15d20ugIV0.3ml/只第17d〜24d内融合2长程免疫方案：第一次：Id100ug+等体积完全佐剂腹腔注射（IP）0.4ml/只第二次:14d100ug+等体积不完全佐剂IP（腹腔注射）0.4ml/只第三次:21dlOOugIP或IV0.4ml/只第四次：25d50ugIV0.3ml/只（强化）第五次:28d20ugIV0.3ml/只第30d〜37d内融合.注意:a.在融合前（即加强免疫前）必须测定免疫鼠血清滴度，短程免疫滴度必须＞1:8000,长程免疫＞1:32000,方可做融合.b•免疫周期完成示所有

3、小鼠需在一周内做完融合.否则不能保证融合质量。二.小鼠免疫质控标准1.免疫鼠血清滴度短程汕8000,长程N1：32000；2.小鼠免疫后需在一周内做完融合；3.免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并仇较粘连。免疫鼠选择：免疫利啖为:baleb/c小鼠；性別.雌性佳：大小：6・7周龄：体重：20g;健壮•活泼。第二章.细胞融合一.融合前准备1.脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液,每只鼠的脾细胞约1〜3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。2.SP2/0细胞准备：SP2/

4、0细胞在融合前4天腹苏.并用8・Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数最在2000万〜3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不宜使用。1.PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积PBS在60°C溶解即可使用，一次融合取O.Xml50%PEG1450.2.HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。3.终止液15・20ml:不含Hepes的1640培养基或PBS（PH7.4）一.融合：制备脾细胞悬液并用PBS（PH9.4

5、）洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:l〜5:2混合并离心,1200rpmx5min离心后滴干混合细胞.轻敲弹松细胞团块。在37°C水浴屮加入PEG14500.8ml在50秒内加完不宜吹打，加完后在37°C水浴屮反应2min后加入终止液在5min内加完15〜20ml,加终止液吋应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。二.融合后加样：融合细胞终止示于900rpmx8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。三.换液：待融合细胞

6、在HAT中培养7天左右后（即未融合的SP2/0和脾细胞死后）换成HT培养基。200U1/7L第8〜10天检测。第三章.细胞建株融合板检测：待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测（检测方法参见附表EL1SA方法）在ELISA质控合格（即阴性对照＜1.0,阳性对照＞1.0）后挑选阳性孔（一般OD450＞0.5）作亚克隆。二•亚克隆方法及检测：挑出融合板阳性孔全部细胞加入8-10mlHT培养基，混均铺板4・6纵行；待亚克隆生长5・7天，克隆长大（约1万个细胞以上/孔），即可检测（用ELISA方法）。一.单克隆铺板和检测：挑取亚克隆

7、检测阳性值高的孔计数作有限稀W4:2:1:0.5个细胞四个梯度铺板1个阳性细胞株/块。待单克隆生长7・10天，单克隆细胞长至中等人小（1万/孔）时进行检测，其中单克隆细胞浹个/株（一般检测12个孔），待检测单克隆全阳后再进行一次同样的单克隆。二.细胞株确立：待两次单克隆检测全阳后挑出三孔/株，作扩大培养于24孔板；24孔板细胞长满后作交义Ag鉴定和稳定性鉴定（即再次测其培养上清看是否还能分泌单抗）鉴定合格后选择其中一株长势好.OD450箱高的扩大培养于细胞瓶，并进行冻存，5支/株，N200万/支细胞。笫四章.细胞株鉴定在细胞株冻存完毕后必

8、须复苏同一批次屮的一支进行鉴定。鉴定标准：1•复苏活细胞数＞100^个细胞/支；2.活细胞中冇活力细胞N50万/株；3.复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物（如:细菌.真菌.支原体等）