单克隆抗体制备技术

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1、单克隆抗体一、抗体的结构与功能1、抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。2抗体动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗

2、体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。二、单克隆抗体的制备•    动物免疫与亲本细胞的选择•    细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备•    杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等•    单克隆抗体的制备和冻存•    单克隆抗体的纯化亲本细胞的选择•    骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶）。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。[小鼠骨髓瘤细胞能在体外无限增殖传代并不分泌抗体。肿瘤细胞DNA生物合成有两条途径：一条

3、由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，这是主要途径。这条途径可被叶酸的拮抗物—氨基喋呤(A)所阻断(但如果培养基中含核苷酸“前体“次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，细胞通过另一途径(称替代途径或应急途径)也可合成核苷酸。但后一途径需次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)存在)。]•    淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。•    免疫方法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。  细胞融合•    将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以

4、2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7¡ª10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞•    细胞团块分散后，加HAT溶液，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，•    用HAT选择性培养时隔4－5天换液，8-10天后可以选择检

5、测。HAT选择系统•    HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。•    DNA合成途径有两种。1.主要途径2.次要途径：•    杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。•    HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；•    TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。•    含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。•    淋巴细胞具有合成DNA的两条

6、途径。•    杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。•    在HAT培养基中，HPRT-或TK-  亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。特异性杂交瘤细胞的筛选•    通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。杂交瘤细胞的克隆化培养•    利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。•    在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进

7、杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞•    或胸腺细胞等。•    方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。有限稀释法•    通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的•    1）取出阳性孔内的细胞进行计数•    2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。•    3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，•    其机率将为每孔内落入一个细胞。•    4）加入一定数量的饲养细胞，•    经过2~3天后，可观察到有集落生长的孔，并标记单克隆。•    10天左右可以检测。•    5）根据检测

8、的阳性结果再次进行克隆化。•    诱生腹水•    将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内