单克隆抗体制备技术（精品）

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1、单克隆抗体一、抗体的结构与功能1、抗原：进入动物体内対肌体的免疫系统产牛刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分了表而具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。2抗体动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋山，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,lg）o动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克降抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克

2、降抗体混合物，称为多克降抗体。二、单克隆抗休的制备・动物免疫与亲本细胞的选择・细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备・杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等・单克隆抗体的制备和冻存・单克隆抗体的纯化亲木细胞的选择・骨髄癖细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，只为HPRT—（次黄瞟吟鸟卩票吟磷酸核糖转移酶）或TK—（胸腺啼唳核昔激齣）。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。［小鼠骨髓瘤细胞能在体外无限增殖传代并不分泌抗体。肿瘤细胞DNA生物合成有两条途径：一条由糖、氨基酸合成核昔酸，进而合成DNA,这是主要途径。这条途径可被叶酸的拮抗物七基喋吟（A）所阻断（但如果培养基屮含核卄酸谕体“次黄嚓吟和

3、胸腺H密唳核井，即便有A存在，细胞通过另一途径（称替代途径或应急途径）也可合成核井酸。但后-途径需次黄瞟吟鸟瞟吟磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺啼唳核营激齣（TK）存在）。］・淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。・免疫方法：对细胞或微牛物抗原町直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化示，注入到动物体内。细胞融合・将免疫脾细胞和小鼠骨髄细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7¡ª10分钟，尽量吸净上清液,用手指轻击管壁,使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加

4、入50%的PEG0.5ml,随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5-10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞・细胞团块分散后，加HAT溶液，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml,・用HAT选择性培养时隔4—5天换液，8-10XA5-可以选择检测。HAT选择系统・HAT是含一定浓度次黄噪吟（H）、氨基喋吟（A）及胸腺唏咙核苗（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。・DNA合成途径有两种。1•主要途径2.次要途径：・杂交瘤技术中，常选用次黄瞟吟鸟嚓吟磷酸核糖转移酶缺陷（HPRF-）骨髓瘤细胞或

5、胸腺□密I症核廿激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲木之一。・HPRT■细胞的瞟吟只能由全合成途径产生；・TK-细胞的唏噪只能由全合成途径合成。・含氨基喋吩培养基抑制了细胞内II票吩和唏呢的全合成途径。・淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。・杂种细胞通过互补作用获得HRFT或TK基因，可应用培养基中次黄瞟吟及胸腺啄喘核芹，通过补救合成途径合成DNA。・在HAT培养基中，HPRT-或TK・亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。特异性杂交瘤细胞的筛选・通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特界性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况

6、來加以选择。杂交瘤细胞的克隆化培养・利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。・在培养过程中，一•般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞・或胸腺细胞等。・方法有有限稀釋法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。有限稀释法・通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的冃的・1）取出阳性孔内的细胞进行计数・2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。・3）如果在96孔板内每孔加0.1ml,・其机率将为每孔内落入一个细胞。・4）加入一定数量的饲养细胞，・经过2~3天后，可观察到有集落生长的孔，并标记单克隆。・10天左右可以检测。・5）

7、根据检测的阳性结果再次进行克隆化。・诱生腹水・将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使具以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。・方法是将降植烷或石醋油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3-5x106杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1-10mg单抗。一般的筛选方法：ELISA：酶联免疫吸附实验，通常用间接法。WB：免疫蛋白印迹。I