《克隆抗体制备技术》PPT课件

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1、第六讲单克隆抗体制备技术1（一）单克隆抗体的概念单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。23免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形

2、成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。4单抗与多抗的不同项目常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲和力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量低高用于常规免疫学实验可用单抗组合应用沉淀反应容易形成一般难形成5表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆

3、抗体单克隆抗体67单克隆抗体制备过程1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取8抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞融合选择性培养抗体分泌细胞筛选克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定9致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式——体内、体外剂量——0.5-100g次数——视抗原而定间隔——视抗原而定佐剂——视抗原而定收集时间：末次接种后72h10骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT

4、缺陷状态HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶11细胞融合方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）12致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞离心1000rpm10min50%PEG1ml培养液10ml离心1000rpm7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内13选择性培养随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理14随机融合后的细胞类型细胞组合HGPRT生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤—不能生长未融合淋巴细胞+

5、短期生长未融合骨髓瘤—不能生长15HAT选择培养原理核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）16抗体分泌细胞的筛选对筛选方法的要求：多——大量样品一次检测快——迅速取得检测结果准——检测结果可靠性高灵——检测方法灵敏度高常用筛选方法：ELISA、IFA等17克隆化过程概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔

6、、胸腺、脾细胞18有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔19单克隆抗体的制取制取方式：体外——培养罐法体内——腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定——是否针对同一决定簇20多抗与单抗制剂的比较多抗单抗单抗（血清）（腹水）（培养上清）特异性抗体含量（mg/ml）0.1-10.5-50.005-0.025无关Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量极少—均一性—++特异性多决定簇单决定簇单决定簇稳定性较

7、好略差略差重复性差好好21单克隆抗体的特性1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一22杂交瘤技术制备单抗23单抗的应用1．在血清学技术方面提高了方法的特异性、重复性、稳定性和敏感性，同时使一些血清学技术得到标准化和商品化，即制成诊断试剂盒。自单克隆抗体技术问世以来，已研制出很多病原微生物的单克隆抗体，可取代原有的多克隆抗体，用于传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体引起的交叉反应。24单抗的应用2．在免疫学基础研究方面对抗体结构和氨基酸顺序的分析应用单克隆抗体对淋巴细胞表

8、面标志以及组织细胞组织相容性抗原的分析:用单克隆抗体对淋巴细胞CD抗原进行分析，可以对淋巴细胞进行分群。25单抗的应用3．在肿瘤免疫治疗方面通过采用杂交瘤技术，制备出肿瘤细胞特异性抗原的单克隆抗体，然后与药物或毒素连接制成免疫毒素（immunotoxin），又称生物导弹，用于肿瘤的临床治疗，这在医学上已获初步成效。26单抗的应用在抗原纯化方面利用单克隆抗体的特异性，可将单克隆抗体与琼脂糖等偶联制成亲和层析柱，可从混合组分中提取某种抗原成分。此技术可与基因工程疫苗的研究相结合，即先用