抗体制备问答

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1、一、抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成a-helix3、N,C端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N,C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重耍的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有-•两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。二、抗原多肽设计的基本原则为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很冇必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时

2、又能产生出对感兴趣的蛋白冇结合能力的抗体。尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，己超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有儿点关键的基木设计原则可以提供给大家参考：1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项H,弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域冇很大的帮助。然而，在没冇这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或

3、在一种特定状态下的蛋H，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的I木I难，然而，蛋白的构彖将影响抗体与其识别区域Z间的相互作用。这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。（无法产生相互作用）。2、识别区域的选择原则i般说來最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表血和结构上易变形性等特点。因为在人多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在责白表而，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的

4、识别区域和互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。3、连续的与不连续的识别区域连续的区域是指山连续的氨基酸序列（残基）构成的识别区域。大多数抗体是针对连续识别区域的，抗体能与这类区域以很高的亲和力相结合表明这段序列不在蛋白内部。不连续的识别区域是代衣有一定折叠的一段多肽序列，或是将两段分离开的多肽连在起的抗体的识别区域。在某些情况下，针对这样不连续识别区域的抗体也能产生，只是用來免疫的抗原多肽必须具备与该不连续识别区域相似的二级结构，而序列的长度需要符合

5、相关的要求。4、基木建议为了避免识别区域隐藏在蛋白内部的风险，我们通常建议选择蛋白的N,C两端來产生的相应的抗体。因为在完整的蛋白中，N,C两端通常是暴踞在蛋白表血的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太强，不适合作为抗原。5、序列的长度通常我们建议抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间，如果太短，就有多肽太特殊、所产生的抗体与天然蛋白Z间的亲和力（结合能力）不够强的风险，同样，如果序列长度超过20,将有可能引入二级结构，所产生的抗体失去特异性的可能，而且肽链越长，通常合成难度増大，不易获得高纯度的产品。6

6、、载体蛋白交联的选择基木原则：将载体蛋白加在远离抗体识别区域的一端，在序列中没有Cys的情况下在N或C端加上Cys为交联的首选方法。7、常用分析软件MacVectorTM;DNAstarTM;PC-GeneTM多肽合成的常见问题（一）问：多肽的两端应如何处理？是保持口由状态还是屏蔽起來？答：多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白冇相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两端的电荷数将与基因体蛋□有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。总体而言：如果是出自蛋白C端的序列，

7、通过乙酰化将N端屏蔽；如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽；如果是出白蛋白屮间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。多肽合成的常见问题（二）问：如果我的肽纯度是95%,那么，英余的5%都是些什么物质？答：多肽的纯度通常是通过HPLC,用每分钟1%的标准乙晴梯度來检测决定的。合成过程中，氨基酸Z间的交联效率不是总能达到100%,因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的儿

8、个百分多肽合成的常见问题（三）问：如何重新溶解多肽？答：多肽的溶解与多肽的序列相关，首先试蒸憾水和超声（1-10MG/ML）,如果不溶，计算肽中的碱性残基（Lys,Arg,His和口由氨基端）和酸性残基（Gly,Asp和自由竣基端）的数目。如果碱性基团偏多，可以滴加1N的醋酸，冑到溶解为止，如果酸性基团居多，滴加1N的氨水，直到溶解为止。如呆在实验屮需要用缓冲液，建议在多