克隆抗体制备方案

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1、单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。1.2免疫原制备　15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入7mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射

2、器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入3mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入2mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推

3、吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取

4、一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。1.3实验步骤初次免疫：50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA）腹腔和皮下注射。（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射）3周后第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2～3周后15加强免

5、疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。3～4天后取脾细胞融合腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。进行腹腔注射时应注意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。3、用的针头不要太粗，以免药液注

6、射后从注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。皮下注射皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。151.4注意事项①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50～100μ

7、g基础上增加。②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积，否则很难乳化好。一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。③佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂，混合的方法有研磨法和注射器混合法。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好；如保持完整不散开，呈滴状漂在水面则为乳化完全。乳化过的物质放置一段时间出现油水分层也表明未乳化好。④测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。用双向免疫法测定时效价达到1：16以上可用于融合实

8、验；用ELISA方法测定时效价达到1：16000后可用于融合。皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血