克隆抗体与基因工程抗体制备

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1、单克隆抗体与基因工程抗体制备多克隆抗体(Polyclonalantibody)概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的，称为多克隆抗体。存在的问题为不均一物质特异性和亲和力差,批间重复性差，用于免疫学检测容易出现交叉反应单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)概念:通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.特点:针对单一表位结构相同功能均一杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方

2、亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，杂交瘤技术流程两种亲本细胞的选择与制备细胞融合杂交瘤细胞的筛选与克隆化两种亲本细胞的选择与制备小鼠骨髓瘤细胞免疫脾细胞骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％一般要求：与骨髓瘤细胞同源的小鼠（Balb/c小鼠）8～12周龄20g～25g体重用高纯度高活性抗原刺激免疫小鼠免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性

3、B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）。冲击免疫（融合前3天进行）颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果细胞融合当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。骨髓瘤细胞PEG杂交瘤细胞脾细胞细胞融合剂：PEG作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同厂商、批号、分子量的P

4、EG，其纯度与毒性有所不同免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后改用一般培养液融合后细胞的类型:未融合的脾细胞（寿命短，5-7天死亡）杂交瘤细胞（分泌抗体和永生性）未融合的瘤细胞杂交瘤细胞的筛选与克隆化细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理HAT

5、选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)具永生性2.HGPRT+在HAT生长PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）融合后不同细胞在HAT培养基的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞阳性杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培养孔生长多个细胞群落，必须筛选。一般在杂交瘤细胞

6、布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞阳性杂交瘤细胞的冻存阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%

7、～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液