单克隆抗体与基因工程抗体的制备分解ppt课件.ppt

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1、单克隆抗体与基因工程抗体的制备抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)杂交瘤技术的基本原理单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生二、单克隆抗体的纯化三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性基因工程抗体制备一、基因工程抗体种类二、原理三、重组抗原制备过程基本概念抗原决定簇（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).由一个B淋巴细胞增殖而

2、成的细胞集团针对多种抗原决定簇的混合抗体由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养

3、：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤 细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体流程杂交瘤技术不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞

4、膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)50%PEG1min内加完;10ml培养液终止反应融合方法SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT培养液细胞融合7～20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养HAT培养基：H（Hypoxan

5、thine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA杂交瘤细胞的选择性培养HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方

6、法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清Ab难以去除腹腔注射法盐析沉淀亲和层析离子交换层析二、McAb的纯化Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的

7、交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方