单克隆抗体的制备.ppt.ppt

《单克隆抗体的制备.ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、丁乔棋2015年8月9号单克隆抗体的制备Monocolonalantibody什么是单克隆抗体？1、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单克隆抗体制备原理-----单克隆抗体杂交瘤技术基本流程在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞③瘤-瘤融合细胞未融合的细胞：④单个的B细胞、

2、⑤单个的骨髓瘤细胞这五种细胞中，①④没有分裂能力，逐渐衰老死亡；③⑤的DNA复制只有D途径，加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，也逐渐衰老死亡，但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过S途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。单克隆抗体的制备步骤一：免疫原的制备：1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000Da物质3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体单克隆抗体的制备

3、步骤免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的BalB/C。免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。免疫程序：免疫剂量、免疫途径、免疫次数、间隔时间、佐剂的选择。二.动物免疫单克隆抗体的制备步骤抗原接种单克隆抗体的制备步骤三：细胞融合细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了B淋巴细

4、胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。所需试剂：培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同单克隆抗体的制备步骤三.细胞融合步骤培养骨髓瘤细胞1：选择对数生长期的细胞进行传代培养。2：胞形

5、态：浑圆、透亮、均一、排列整齐3：避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞饲养细胞的制备2：固定小鼠，切开皮肤，夹起腹膜。3：往小鼠腹腔注射适量不完全培养液:，吹打几次。4：抽出腹腔培养液，加入一定量的不完全培养液，加入血清，使血清浓度为20%。5：分装至96孔板，co2培养箱培养。脾细胞的制备1：取已免疫小鼠，眼球采血，分离血清作对照血清。2：拉颈处死，泡于75%酒精中。3：开腹取脾4：在不完全DM液中碾磨脾脏至粘稠5：收集脾细胞，离心。●·1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。单克隆抗体的制备步骤1：将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加D

6、M液，混匀2：离心，弃上清，磨成糊状3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG14504：加入DM液5：离心，弃上清6：HAT重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱7：五天后，15%血清的HAT补液8：八天后，彻底换15%血清DM液三.细胞融合ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选间接ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤六：亚克隆是为了获得稳定的阳

7、性菌株对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失单克隆抗体的制备步骤筛选阳性细胞孔HAT重悬阳性孔内的细胞取10ul做倍比稀释目标孔：80-100个细胞将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔按上述方法进行第二，第三次亚克隆第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养六：亚克隆每次亚克隆后要进行细胞的冻存保种单克隆抗体的制备步骤1：在

8、建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故。2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1“慢冻”：分步