乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究

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1、乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究TheresearchofhepatitisBsurfaceantibodyaffinitymaturation作者姓名：张天娇专业名称：生物医学工程指导教师：宿晓云副教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月25日中文摘要乙型肝炎作为全球十大致死性疾病之一，严重影响人类的生命健康。现阶段对于乙型肝炎来说还是预防为主，各类抗病毒药物的应用并没有取得令人满意的效果。但是，抗乙型肝炎病毒抗体的出现对乙型肝炎产生有效的防治作用，为乙型肝炎的防治带来新的希望。随着基因工程技术和结构生物学的飞速发展，对抗体的研究和应用起到了巨大的推进作用。通过基因工程技术改造

2、的抗体虽然具有较好的特异性，但是操作繁琐，工作量大。结构生物学的发展有效的弥补了基因工程技术在抗体改造中的不足，可以通过计算机模拟技术对基因工程抗体的亲和力进行计算，减少突变抗体的数量，并进行进一步的优化。本课题通过计算机模拟技术对已获得的乙肝表面抗体亲和力进行优化，并通过生物学实验对其亲和力进行验证。我们首先利用生物信息学方法研究了乙肝病毒表面抗原M（MiddleHepatitisBSurfaceAntigen,MHBsAg）和目标抗体的序列特征，并从已有的数据库中分别找到了与之同源性较高、质量比较好的晶体结构。接着，利用同源模建技术以晶体结构1WZ4为模板构建了目标病毒MHBsAg

3、表位的三维结构，以晶体结构4JDT中的H链和晶体结构4KMT中L链为模板同源模建了目标抗体的重链和轻链，参考晶体结构1F11中抗体轻链和重链的组装方式构建了目标抗体的三维结构。然后，利用分子力学技术，先后通过最陡下降法和共轭沉降法两步对预测得到的MHBsAg表位和抗体复合物结构进行了适度优化。接着，通过分子对接技术将优化后的MHBsAg表位与目标抗体结构进行蛋白质‐蛋白质分子对接，优选出了目标病毒MHBsAg表位与目标抗体的较好的结合方式。该结合模式中MHBsAg表位的一个螺旋部分镶嵌在轻、重两条链的loop区中间，MHBsAg的两个螺旋所形成的角度也尽可能多地把重链的CDR3区包住，

4、增大了抗原‐抗体之间的相互作用，增强了抗体对抗原的识别，这些与之前的文献调研结果相符合。在对抗原‐抗体复合物进行了适度优化之后，我们对二者之间的相互作用进行了结构分析。在这个结合状态中，MHBsAg能够很好的嵌入到抗体复合物轻链和重链CDR3区形成的凹槽中间，并与之进行充分地接触，在二者之间共产生了8个氢键相互作用，1个盐桥相互作用和1个阳离子‐π相互作用。在氢键相互作用中，抗体轻链参与的氨基酸主要有两个，Arg30和Tyr32，重链参与的氨I基酸主要有4个，Tyr32、Arg98、Gln108和Tyr109，而MHBsAg表位参与的氨基酸有8个，Asn1、Ser2、Gln4、Phe5

5、、His6、Tyr18、Gly22和Gly23。以这些相互作用为线索，对抗体轻链上的Arg30，Ala50和重链上的Arg98进行饱和突变，通过计算获得了突变前后的自由能变化图谱。将这三个位点联合突变为结合能最大的氨基酸残基，构建抗体突变体并诱导表达，对其活性鉴定发现联合突变体的亲和力明显高于未经过结构优化的抗体。综上所述，本课题通过计算机模拟技术实现了对乙型肝炎表面抗体结构的优化，并且通过生物学方法证明经过结构优化的抗体亲和力确实得到了明显的提升。为全人源化乙型肝炎表面抗体的临床应用奠定了基础。关键词：乙型肝炎抗体，亲和力成熟，结构生物学，同源模建法，分子对接法IIAbstractH

6、epatitisBisthemostfataldiseaseintheworldandhasseriousimpactonthelifeandhealthofhumanbeings.Atpresent,preventionisthemosteffectivewaytocontroltheprevalenceofHepatitisB.HepatitisBcannotbeeffectivelycuredbyantiviralagents.Anti-hepatitisBvirusantibodyistheneworientationforthepreventionandtherapyofhe

7、patitisB.Theresearchandapplicationofantibodywasadvanceddramaticallybythedevelopmentofgeneticengineeringtechnologyandstructurebiology.Although,geneticengineeringantibodieshavebetterspecificitythannaturalantibodies,theirresear