玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法

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1、玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法    NY／T 449—20011范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。2引用标准　　下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。　　GB／T3543．2—1995农作物种子检验规程扦样　　GB／T3543．5—1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定　　GB4404．1—1996粮食作物种子禾谷类3定义　　本标准采用下列定义。3．

2、1种子真实性　　供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。3．2品种纯度　　品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。[GB／T3543.5]3．3育种家种子　　育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。4原理　　从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。5仪器设备及试剂5．1

3、仪器设备　　电泳仪(500V±5V连续可调、0～400mA连续可调、额定输出功率200W)、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平(感量0．0lg、0．001g、0．0001g各一台)、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机(5000r／mln以上)、电冰箱、电炉、离心管(1．5mL)、离心管架、移液管(10mL、5mL、2mL各两支)、微量进样器(5～100μL)、恒温箱、观片灯等。5．2试剂　　丙烯酰胺、NN－亚甲基双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R250、无水乙醇、（略：正丁醇等）(所用试剂均为分析

4、纯，所用水均为去离子水)。6溶液配制6．1电极缓冲液　　称取甘氨酸6.00g，倒人2000mL烧杯中，加入1800mL去离子水溶解，用2.0-4.0mL乳酸调至pH3.3，再加去离子水定容至2000mL，混匀。6．2样品提取液　　称取氯化钠5.80g，蔗糖200.00g，甲基绿0.15g，倒人1000mL烧杯中，加去离子水800mL溶解，加热至微沸，放至室温，再用新煮过的去离子水定容至1000mL。在4℃条件下保存（5天有效）。6．3分离胶缓冲液　　取1.43mL乳酸钠于1000mL烧杯中，加去离子水980mL，用乳酸调至pH3.0（约5.8—6mL），再加去离子水定容

5、至1000mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。6．4分离胶溶液　　称取丙烯酰胺112.50g，NN－亚甲基双丙烯酰胺3.75g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg（或硫酸亚铁溶液，称取0.8g硫酸亚铁，定容至100mL容量瓶，吸取1mL即可），用分离胶缓冲液溶解，再用分离胶缓冲液定容至1000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存(不超过14天)。6．5浓缩胶缓冲液　　取1.50mL乳酸钠于1000mL烧杯中，加去离子水400mL，用乳酸调至pH5.2（用移液管约2滴），再加去离子水定容至500mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。6．6浓缩胶溶液　　称取丙烯酰胺

6、30.00g，NN－亚甲基双丙烯酰胺5.00g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁4.0mg（或硫酸亚铁溶液0.5ml），用浓缩胶缓冲液溶解，再用浓缩胶缓冲液定容至500mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存(不超过7天)。6．73％的过氧化氢溶液　　取30％的过氧化氢4mL，加36mL去离子水，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。6．8染色液　　称取考马斯亮蓝R2502.00g，在研钵中用100mL无水乙醇研磨溶解（不断加入），过滤于棕色瓶中。取10mL该溶液，加人到200mL的10％(WVV)三氯乙酸溶液中，混匀。（称取200g三氯乙酸，加入2L去离子水配置三氯乙酸溶液）。7电

7、泳检测操作7．1样品制备　　按GB／T3543.2的要求，从送验样品中随机分取玉米种子至少100粒，用单籽粒粉碎器粉碎，放人1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，摇匀，放置5min后，再摇一次，30min后，用离心机离心(5000r／min)15min，取上清液用于电泳。7．2凝胶制备7．2．1胶室制备　　将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，然后把胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极（内侧），拧紧螺栓，备用。7．2．2封底缝　　根据电泳槽大小，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3％的过氧化氢溶液(一