NYT449-2001-玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法.pdf

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1、B20NY中华人民共和国农业行业标准NY/T449-2001玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法Identificationpurityofmaizevarietyusingsaltinginproteineletrohporesis2001一08一20发布2001一11一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T449-2001前言本标准由农业部市场与经济信息司提出。本标准起草单位:农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心、吉林省农作物种子质量监督检验站、北京市种子质量监督检验站。本标准主要起草人:辛景树、赵建宗、丁万志、贾希海、黄庭军、王汝宝、刘玉欣、苏菊萍、徐献军、吕小瑞、王秀荣

2、、孙波、冯晓东、陈雅君、余有海、班秀丽。中华人民共和国农业行业标准玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY/T449-2001Identificationpurityofmaizevarietyusingsaltinginproteineletrohporesis范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T3543.2-1995农

3、作物种子检验规程扦样GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB4404.1-1996粮食作物种子禾谷类3定义本标准采用下列定义I1种子真实性供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。3.2品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[GB/T3543.5113育种家种子育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子、用于进一步繁殖原种的种子。4原理从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酸胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成

4、的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。5仪器设备及试剂5.1仪器设备电泳仪(500V士5V连续可调,0^400mA连续可调、额定输出功率200w)、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平(感量0.01g,0.001g,0.0001g各一台)、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机(5000r/min以上)、电冰箱、电炉、离心管(1.5ml)、离心管架、移液管(10mL,Sml-,2mL各两支)、微量进样器(5-中华人民共和国农业部2001一08一20批准2001-11一01实施NY/T449-2001100VL),恒温箱

5、、观片灯等。5.2试剂丙烯酞胺,N,N'一亚甲基双丙烯酞胺、乳酸、乳酸钠、甘氮酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R250、无水乙醇、正丁醇等(所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。6溶液配制6门电极缓冲液称取甘氨酸6.00g，倒人2000mL烧杯中，加人1800mL去离子水溶解，用2.0mL乳酸调至pH3.3，再加去离子水定容至2000mL,混匀。6.2样品提取液称取氯化钠5.80g，蔗糖200.00g，甲基绿。.15g，倒人1000MI烧杯中，加去离子水800m工一溶解，加热至微沸，放至室温，再用去离子水定容至1000mL。在

6、4C条件下保存。6.3分离胶缓冲液取1.43mL乳酸钠于1000mL烧杯中，加去离子水980mL，用乳酸调至pH3.0，再加去离子水定容至1000ml-,贮于棕色瓶中，在4C条件下保存。6.4分离胶溶液称取丙烯酞胺112.50g,N,N‘一亚甲基双丙烯酞胺3.75g，抗坏血酸。.25g，硫酸亚铁8.Omg，用分离胶缓冲液溶解，再用分离胶缓冲液定容至1OOOmI，过滤于棕色瓶中，在4C条件下保存(不超过14天)。6.5浓缩胶缓冲液取。.30mL乳酸钠于200ml烧杯中，加去离子水90mL，用乳酸调至pH5.2.再加去离子水定容至100ml-，贮于棕色瓶中，在4C条件下保存。6.6浓

7、缩胶溶液称取丙烯酸胺6.00g,N,N，一亚甲基双丙烯酞胺1.00g，抗坏血酸0.03g，硫酸亚铁。.8mg，用浓缩胶缓冲液溶解，再用浓缩胶缓冲液定容至100ml，过滤于棕色瓶中，在4'C条件下保存(不超过6天)。6.73%的过氧化氢溶液取30%的过氧化氢1ml，加9ml去离子水，贮于棕色瓶中，在4'C条件下保存。6.8染色液称取考马斯亮蓝R2502.00g，在研钵中用100ml无水乙醇研磨溶解，过滤于棕色瓶中。取10mL该溶液，加人到200mL的10%(W/V)三氯乙酸溶液中，