DB14∕T 122-2005 玉米种子纯度等电聚焦电泳鉴定方法

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1、ICS65.020.20B21DB14山西省地方标准DB14/T122—2005玉米种子纯度等电聚焦电泳鉴定方法Identificationpurityofmaizevarietyusingisoelectrofocusingelectrophoresis2005-04-20发布2005-05-20实施山西省质量技术监督局发布DB14/T122—2005前言本标准由山西省农业厅提出。本标准由山西省农业种子总站、农业部农作物种子质量监督检验测试中心（太原）、北京市农林科学院玉米中心、泽州县种子公司共同起草。本标准主要起草人：王圆荣、杨军、赵久然、郭景伦、苏菊萍、段民孝、孟全业、王虎瑞、张

2、芸、韩继华、武艳丽。本标准委托山西省农业厅负责解释。本标准首次发布时间为2005年1月30日。IDB14/T122—2005玉米种子纯度等电聚焦电泳鉴定方法1范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。本标准适用于玉米单交种和亲本的真实性和品种纯度鉴定。2规范性引用文件下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成本标准的条文，标准出版时所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用最新版本的可能性。GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB4404.1-1996粮食作

3、物种子禾谷类3术语和定义GB/T3543.5所确立的及下列术语和定义适用于本标准。品种：指在形态特征和生物学特性(遗传、生理、细胞、化学、生态等)基本一致的一个栽培作物的群体，经繁殖仍能保持其特性，并通过正式鉴定，具有一个公认的名称。4原理等电聚焦电泳是通过电荷效应、分子筛效应和PH梯度等的作用，使等电点不同的蛋白质等大分子固定在凝胶的不同部位，形成一定的谱带。不同玉米品种或变种的遗传基因有差异，种子内所含蛋白质种类也就不同，不同蛋白质等电点不同，这种差异可利用等电聚焦电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。5实验条件5.1本方法要求实验室温度为20℃-25℃。5.2本方

4、法所用药品试剂均为分析纯，配置试剂所用水均为去离子水。6仪器设备及试剂6.1仪器设备：天平、电冰箱、磁力搅拌器、酸度计、电泳仪、水平电泳槽、高速离心机、观片灯、单粒粉碎器、微量加样器、移液管、量筒、容量瓶。6.2试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蔗糖、过硫酸胺、四甲基乙二胺、顺丁烯二酸、磷酸、氢氧化钠、正丁醇、丙三醇、两性电解质、TRITON、α奈酯、坚牢蓝RR、乙酸。7试剂配制7.1电极缓冲液7.1.1称取氢氧化钠4.00g，加去离子水定容至100ml。7.1.2用移液管取磷酸11.3ml，加去离子水定容至100ml。7.2样品提取液称取蔗糖40.00g加去离子水定容至100ml。1D

5、B14/T122—20057.3凝胶贮液7.3.1用移液管取四甲基乙二胺1ml，加去离子水定容至100ml，棕色瓶贮于冰箱。7.3.2用移液管取甘油23ml，加0.6mlTRITON，加去离子水定容至100ml，棕色瓶贮于冰箱。7.3.3称取丙烯酰胺15g，甲叉丙烯酰胺0.4g，加去离子水定容至1000ml，过滤于棕色瓶，贮存于冰箱。7.4催化剂称取过硫酸铵0.5g，加去离子水定容至50ml，贮存于冰箱（不超过7天）。7.5染色液7.5.1称取顺丁烯二酸5.8g，氢氧化钠3.08g，加去离子水定容至1000ml。7.5.2称取α奈酯1.0g，加正丁醇定容至100ml。8电泳操作8.1样

6、品制备用分样器从净度分析后的玉米净种子中分取不少于100粒种子，每粒取半个籽粒（或浸种8-12小时取胚，或发芽3-7天取芽），单粒粉（研）碎，放入离心管，加入0.2ml样品提取液，摇匀静置30min，1800rpm离心15min，取上清液用于电泳；8.2凝胶制备8.2.1准备胶室。将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条，用铁夹夹紧固定。8.2.2灌胶。将试剂7.2、7.3.1、7.3.2、7.3.3、两性电解质、水和7.4液按1.8ml:3.4ml:3.7ml:3.5ml:0.7ml:6.7ml:0.55ml比例配制20ml（适量）凝胶溶液，迅速摇匀，倾斜玻璃板，将凝胶溶液倒入两玻璃板间，排出

7、气泡水平放置，30-40分钟凝固,取下夹子小心撬起一块玻璃板，取下橡胶框备用。8.3点样。用镊子将样品条(小滤纸片)沾取样品上清液后,整齐摆放到胶板偏负极1/3处。8.4电泳。点完样后，负极用7.1.1液,正极用7.1.2液湿润电极条后,连接好冷却水，将电源线连接好，检查无误后，接通电源，50V电压电泳60分钟，关闭电源揭下样条，再接通电源250V电压电泳60分钟，500V电压电泳75分钟，关闭电源和冷却水。8.5卸板染色。将胶板小心取下，在7