等电聚焦电泳 介绍

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1、等电聚焦电泳介绍点击次数：315作者：佚名发表于：2008-08-0700:00　转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%TritonX100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mmpH4-

2、6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。水：5.4ml；储存液1）：2.0ml；载体两性电解质溶液pH3.5-1048μl；载体两性电解质溶液pH4-6240μl；超纯尿素6.0g；10%过硫酸胺25μl；TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将

3、凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20μl；3）pH4-6载体两性电解质：100μl；4）20%TritonX－100：5

4、00μl：5）2－巯基乙醇：50μl；双蒸水：1.7ml；1%溴酚蓝：200μl电泳：操作步骤：1.将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；2.用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30μg的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10μg单一蛋白组分是较合理的上样浓度。电泳液：1.上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；2.下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。等电聚焦电泳条件：1.接好电极；2.恒压150V电泳30min；3.恒

5、压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。电泳聚焦后处理：测定pH梯度：1.将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；2.将每小片凝胶在1ml10mMKCl中浸泡30min；3.测读此KCl溶液的pH值、凝胶的固定：1.将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；2.换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。======================================

6、========================产品>>>实验室(LAB)>>>生命科学仪器>>>电泳系统>>>六一电泳仪>>>DYCP-37B等电聚焦多用途电泳槽DYCP-37B等电聚焦多用途电泳槽=============================================================等电点标准蛋白（pH3－pH10）试剂盒聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测蛋白质的等电点2010-04-0513:08:12来源：易生物浏览次数：38网友评论0条所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（α-amino）。這些可游离的基团随着pH

7、变化可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）及负电荷（anion）等三种，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。关键词：电泳酰胺聚丙烯聚丙烯酰胺等电聚焦电泳蛋白质等电点等电聚焦电泳isoelectricfocusingIEF实验原理所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carbo