等电聚焦电泳的两种方法

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1、等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点        等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电

2、荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine、2％TritonX-100、9M尿素三、操作步

3、骤：1,样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。3,配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1mlAmpholine(pH3.5-10)60-80ul10%AP5ulTEMED4,灌胶：配好的胶迅速灌入模具5,电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电

4、极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。6,表面电极测定蛋白质的pI7,固定：取出塑料片，放入固定液中15min8,染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现9,可脱色至背景消除后干燥保存。四、结果（略）五、注意事项1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。3、过硫酸铵一定要新配置。4、所有水用重蒸水。5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走

5、歪，拖带或根本不成带。6、平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。【原理】      蛋白质（酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与性质，随所处环境的pH而变化。环境pH低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；环境pH等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极向阴极，pH由低到高的连续而稳定pH梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的pH与其自身等

6、电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH环境位置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋白质区带。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定其各种蛋白质“聚焦”部位的pH，即可得知它们的等电点。在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是一类两性电解质。它具有依次递变但相差不大的等电点（PI），在电场中可以形成逐渐递变而又连续的pH梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对pH梯度的影响；在等电点处还具有足够高的

7、电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。为防止电泳过程中，因为对流现象使已经聚焦的蛋白质区带再混合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度。用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作为支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分析分离。其他支持剂适用于制备。【试剂与器材】1.两性电解质Ampholine，pH3

8、~10，浓度40％。2.丙烯酰胺（Acr）溶液：Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（B