等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定

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1、http://www.paper.edu.cn等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步1测定常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@163.com摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等

2、电点。经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速[1][2]血液凝固，达到迅速止血的目的。凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gl

3、y或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上[1]被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶[1]的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法

4、，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或[2][4][5][6]2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道，[7]将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。随着系统生物学和蛋白质组学的

5、迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（IsoelectricFocusing,IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37kDa，由两条多肽链通过一[2]个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。

6、这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。2.等电聚焦基本原理1本课题得到学校“211工程”基金资助。-1-http://www.paper.edu.cn等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)是1966年由瑞典科学家HarryRilbe和OlovVesterbery建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同在一个稳定的

7、、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离分析。蛋白质是由不同数量和比例的L-α氨基酸组成的。氨基酸侧链在不同的pH环境中带不同的电荷。当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH

8、，本技术可依据等电点的不同将蛋白质分子分离，并且反之根据蛋白带pH在梯度中的位置测得该蛋白质的等电点。构成凝胶介质pH梯度的载体两性电解质是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构物和同系物组成的。载体两性电解质在凝胶中形成pH梯度的时间约为