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1、P物质在奶牛临床型乳腺炎肾组织中的作用【摘要】应用组织化学和免疫组织化学方法对正常与临床型乳腺炎奶牛肾组织中P物质表达水平、炎性细胞以及肥大细胞的活力、组化性质的变化进行了研究。结果表明：P物质在奶牛临床型乳腺炎肾间质中异常丰富，同时在皮质的肾小管间质及血管周围均有高水平的表达，呈单根或交错呈网状走行,并与肥大细胞串联及相邻排列，而MC和炎性细胞也急剧增多,它们均极显著高于正常奶牛(p.01),并与P的表达水平相吻合。结论：P物质参与乳腺炎病理过程中所致肾组织损伤与肾功能衰竭的病理进程。【关键词】奶牛；临床型乳腺炎；肥大细胞；P物质；
2、肾损伤奶牛乳腺炎(Bovinemastitis)是引起奶牛养殖业重大经济损失的主要疾病之一。它不仅危害奶牛健康，降低产奶量,影响奶的品质及奶牛繁殖性能，而且治疗期间长期使用抗生素,致使牛乳中抗生素残留和耐药菌株的出现，造成治疗难度的增加，并严重危害了人类健康和奶牛业产品的市场竞争力。目前,兽医领域正积极开展乳腺炎非抗生素治疗药物的研究，尤其是在抗生素中药替代物方面，有较多的报道。但是，多数研究仍主要沿用了抗生素治疗中单纯抗菌的思路，即只注重对微生物的杀灭，而忽视了奶牛本身的炎症反应所引起的微循环障碍问题。近年来国内外许多学者已经把研究
3、重点集中在提高机体的自然抗病能力上。作为机体主要的天然免疫细胞一一肥大细胞(MastCell,MC)以及神经肽P物质(SubstanceP,SP)来说，研究已发现在肠易激综合征发病机制中起到重要作用［1］;并参与多器官衰竭的病理生理机制［2］；同时也发现在增生性瘢痕、扁平苔聲、变态性皮炎、白瘢风等皮肤性疾病的发展中起关键作用［3-6］。但二者在乳腺炎发病机制中对肾脏发挥何种作用，仍未见报道。本实验主要研究奶牛乳腺炎发病机制中，肾组织中P物质的作用，揭示奶牛乳腺炎发病过程中所致多器官衰竭的病理机制，为奶牛乳腺炎的预防和治疗提供免疫学的治
4、疗途径，在临床有广阔的应用前景。1•材料与方法1.1材料1.1.1实验材料正常奶牛肾脏(4例)与临床型乳腺炎奶牛肾脏的标本(2例)分别采自宁夏新城牛羊屠宰场。1.1.2试剂甲苯胺蓝为Serva产品；阿尔辛蓝(Alcianblue)和蕃红0(Safranin0)均为Sigma产品；兔抗鼠P物质多克隆抗体、生物素化的羊抗兔IgG抗体、链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC复合物)、5%BSA封闭液、浓缩型DAB试剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司；其他有机和无机试剂均为AR级。1.2方法1.2.1肾组织的取材与切片的制备将正常
5、及临床型乳腺炎奶牛的肾组织用0.9%Nacl冲洗2-3次，切成3-5mm大小的组织块，分别放入10%的中性甲醛固定48h,制备5um厚的不连续石蜡切片。1.2.2肾组织的病理学观察H.E染色检测临床型乳腺炎肾组织的病理学变化。1.2.3肾组织肥大细胞的检测正常及临床型乳腺炎肾组织切片按常规脱蜡复水，然后投入甲苯胺蓝-高猛酸钾染液中染lmin,30%乙醇-PBS(pH7.3)分色。镜下控制分色时间，快速脱水透明封片，以显示临床型乳腺炎肾组织肥大细胞的形态、分布数量及脱颗粒状态。1.2.4肾组织肥大细胞颗粒异质性的检测切片按常规脱蜡、复水
6、，转入PBS(pH7.3)中5min,随即在含0.5%Alcianblue8GX的3%醋酸溶液中40min,PBS冲洗5min,入含0.25%Safranin0的0.25mol/L盐酸溶液中染色lmin,PBS冲洗，快速脱水透明并封片，显示临床型乳腺炎肾组织肥大细胞颗粒的异质性。1.2.5P物质表达水平的检测切片常规脱蜡复水，用3%H202孵育lOmin,以阻断内源性过氧化物酶，蒸馆水冲洗，浸入0.Olmol/L枸椽酸盐缓冲液（PH6.0）,92〜98°C水浴处理15min,进行抗原修复，待自然冷却后，PBS冲洗，滴加5%BSA封闭液
7、20min,甩去多余的液体，滴加兔抗鼠P物质多克隆抗体（1：100）30〜50ul,37°C孵育lh,PBS冲洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG抗体30〜50ul,37°C孵育20min,PBS冲洗，滴加SABC复合物，37°C孵育20min,PBS冲洗，DAB室温显色，镜下控制显色时间，蒸馆水冲洗终止反应，苏木精或改良甲苯胺蓝复染，常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤同上。小肠为阳性对照。以显示肾组织P物质的表达水平及P物质与肥大细胞的相关性。1.3数据处理在400倍放大视野中分别计数正常与临床型乳腺炎奶牛肾组织横切
8、不连续切片10个视野的炎性细胞数、肥大细胞数和其中脱颗粒数，所有数据进行统计学处理，其结果用X±S表示。均数比较采用t检验进行显著性分析。1.结果2.1肾组织的病理组织学变化表1正常与临床型乳腺炎奶牛肾组织炎性细胞、肥大
