资源描述：
《通过随机突变提高抗tnf_α单链抗体的亲和力》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2005,21(4)445·论著·文章编号:1007-8738(2005)04-0445-04通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力汪保安,陈晓穗,王欲晓,曲佳,周丽君,王琰3(海军总医院中心实验科,北京100037)Improvingtheaffinityofananti2TNF2α噬菌体抗体库技术的进展为抗体性能的改良提供了重要技术手段,其中体外抗体亲和力成熟的成scFvbyrandommutation[1]功最为突出。体外亲和力成熟的基本策略,是先WANGBao2an,CHE
2、NXiao2sui,WANGYu2xiao,QU在目的抗体基因中引入突变,构建突变抗体库,然后3[2]Jia,ZHOULi2jun,WANGYan再通过生物淘筛选择高亲和力的突变抗体。引入CentralLab.,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China突变可采用多种技术途径,其优劣尚有待评价。[Abstract]AIM:Toimprovetheaffinityofananti2DNA交换是将一组含有不同突变的同源序列在体外TNF2αscFv.METHODS:Amutantphageantibodylibrary进行DNA重组,使不同分子
3、的突变重新组合,以改[3]derivedfromananti2TNF2αscFvgenewasgeneratedbyer2善目的基因的生物学活性。本实验中,我们先以ror2pronePCR.Themutatedgeneswerethensubjectedto错配PCR对1株抗TNF2α的单链抗体(scFv)基因引DNAshuffling.Mutantswithimprovedaffinitywereselected入随机突变,再以DNA交换使突变重新组合增加多bybio2panning.Affinityimprovementoftheselectedmu2样性,以期获得亲和
4、力提高的突变克隆。tantswasverifiedbydotblotELISAandthiocyanateelusionELISA.RESULTS:Onemutantwasobtainedwithrelative1材料和方法affinityindex(1.37mol/L)higherthanthatoftheparent1.1材料抗TNF2α单克隆抗体基因由本室克隆和scFv(0.48mol/L).CONCLUSION:Error2pronePCRplus[4]鉴定,其scFv表达载体pscTNF由本室构建。噬菌DNAshufflingiseffectiveinimprov
5、ingtheaffinityofantibodies.体抗体表达载体p3MH由本室保存。重组人TNF2α[Keywords]error2pronePCR;DNAshuffling;affinity抗原由我实验室表达和纯化。大肠杆菌菌株XL12[摘要]目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。Blue和辅助噬菌体VCSM13为本实验室常规保存。方法:应用错配PCR技术在抗TNF2αscFv基因中引入随机突各种内切酶均为TaKaRa公司的产品。T4DNA连接变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排酶和DNA回收试剂盒均购于Promega公司。H
6、RP2抗组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体M13抗体购自Pharmacia公司。HRP2羊抗鼠Fab购库进行淘筛。挑选活性得到改良的克隆,用斑点ELISA法及自Pierce公司。PCR引物均为本室设计,上海博亚硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:对PCR公司合成。错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种,经1.2方法DNA交换进一步构建变种库后,筛选获得1个亲和力提高的1.2.1构建错配PCR变种抗体库以质粒pscTNF克隆,其相对亲和指数为1.37mol/L,较亲本抗体的相对亲为模板,设计合成scFv基因两侧载体序列互补的引和指数0.
7、48mol/L有明显提高。结论:通过错配PCR和DNA物。按照文献[5]的方法进行错配PCR,具体条件:在交换引入随机突变构建抗体库,可有效地提高scFv的亲和力。100μL反应体系中,含100ngDNA模板、0.2mmol/L[关键词]致错PCR;DNA重排;亲和力dATP和dGTP、1mmol/LdCTP和dTTP、5mmol/L[中图分类号]R392.11[文献标识码]A2+2+Mg、0.5mmol/LMn、5UTaqDNA聚合酶,及6μmol/L引物。PCR反应条件:94℃变性60s,收稿日期:2004-0
