单克隆抗体的制备及应用_百替生物

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1、单克隆抗体的制备及应用学生：周宏伟学号：03241导师：顾蕴洁教授王忠教授扬州大学农学院农学系225009摘要：本文着重讨论单克隆抗体的制备及其应用情况。迄今为止，单克隆抗体技术已经较为成熟和完善，并且在很多领域开始发挥着其不可替代的作用。关键词：单克隆抗体制备应用1975年Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，使经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，创立了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多

2、学科的发展。因此说单抗技术是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。1单抗技术的理论依据单抗技术的基本原理为：小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖。采用融合剂（PEG等）将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特怔。既能在人工培养下无限增殖，又能产生特异性抗体。淋巴杂交瘤技术是单抗技术的重要理论依据。在前文中已经述及。Kohler和Milstein将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransfe

3、rase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的

4、连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。象这种用被抗原免疫过的脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤的技术就是杂交瘤技术。上述作为融合剂的仙台病毒在后来的实验过程中被聚乙二醇（PEG）代替。因为聚乙二醇的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题。然而杂交瘤技术的诞生也是免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术贮备。2单抗的制备的基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是适合国内大多数实验室操作的程序。在开展杂交瘤技术制备

5、单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、高压锅、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸www.100biotech.comservice@100biotech.com管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管

6、（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。2.1动物免疫2.1.1抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫

7、原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。2.1.2免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他

8、动物。种间杂交瘤一般分泌