单克隆抗体的制备及应用

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1、单克隆抗体的制备和应用喻德翔摘要：抗体是机体免疫系统的重要效应分子，单克隆抗体（monoclonalantibodies，mAbs）是将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体。通常采用杂交瘤技术来制备。单克隆抗体技术的发展开创了医学和生物学基础研究的新纪元，为疾病治疗、临床试验和科研做出了巨大贡献。本文就单克隆抗体的制备、应用研究及未来发展进行了论述。关键词：集体免疫；单克隆抗体；杂交瘤细胞；制备；应用研究；1975年，分子生物学家Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵

2、阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体(mAbs)。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆

3、化、冻存、单抗的鉴定等。目前，制备mAbs的方法中比较成熟的主要有以下几种：1.抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术；2.人-鼠嵌合抗体制备技术；3.噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；4.转基因小鼠制备的人mAbs；5.核糖体展示技术。通过这些方法，我们利用相应抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发展。1.单克隆抗体的制备及研究进展1.1鼠源性抗体至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs来诊断和治疗多种人类疾病然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（

4、humananti-mouseantibody,HAMA），很大程度上限制了mAbs的临床应用。此外，鼠源性mAbs不能与人类抗体FcRn结合。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。1.2人-鼠嵌合抗体嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人mAbs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得4的单抗降低了在人体内的免疫反应。CDR移植抗体，又称改型抗体，它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR代替鼠FR，形成

5、的只剩3个鼠源CDR的、更为完全的人源化抗体。由具有支持作用的FR不仅为CDR的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的至还丧失了抗原结合能力。通过大量研究，我们发现选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR和FR的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留CDR移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。因此，相对于嵌合抗体，第二代人源化抗体-CDR移植抗体的人源化程度能达到70%以上，有

6、利于其在临床试验中的应用与研究。1.3完全人源性抗体为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术和转基因小鼠技术等。1.3.1噬菌体展示技术噬菌体展示技术就是将外源基因通过基因工程技术插入丝状噬菌体基因组中，从而在噬菌体表面以融合蛋白的形式展示。该技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来，从而得到全套的噬菌体库。近年来该技术在众多基础和应用研究领域如免疫学、

7、细胞生物学、药物开发中产生的影响已日渐明显。噬菌体展示首先是通过大肠杆菌特异性的噬菌体发展起来。在噬菌体表面所展示的是随机肽段或蛋白质的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体，它的最大特点是实现了直接将基因型和表型完美的结合在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体。其中美国Scripps研究所Lerner实验室在1989年首次应用噬菌体表面展示技术构建了噬菌体抗体库。至今，由这一技术产生的抗体至少有14个已用于临床试验中。然而，它还存在着如未经免疫获得的抗体亲和力相对较弱，抗体库的库容无法涵盖一些动物的抗体多样性等缺点，因此

8、，大容量抗体库的亲和力和抗体多样性问题将是我们今后研究抗体库技术所