大鼠neuritnin的克隆及表达_百替生物

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1、大鼠neuritnin的克隆及表达于娜黄瑾张峪涵潘泽民何玲杨磊新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室，石河子832002关键词：大鼠neuritin基因克隆非融合表达载体原核表达神经营养因子是指机体产生的能够维持神经细胞生长、存活和分化以及促进损伤后再生修复的一类蛋白质因子，对神经损伤和神经系统退行性疾病的治疗和预防有着重要的意义。Neuritin又名CPG15(Candidateplasticity-relatedgene15)[1],是1993年发现的一种新的神经营养因子，初步功能研究表明能促进神经突起的快速生长和分支[2],故其在神经再生领

2、域中有着较好的应用前景。我们为了能够获取大量的具有天然活性的Neuritin蛋白，进一步探讨Neuritin在神经再生中的作用，利用基因工程技术，设计引物构建了neuritin非融合原核表达载体，实现Neuritin在大肠杆菌的原核表达，从而为下一步Neuritin的功能研究提供了有利的条件。1材料与方法1.1.1材料取自SD成年大鼠脑组织1.1.2试剂总RNA提取试剂TRIZOL购自Invitrogen公司，限制性内切酶、随机引物、RNA酶抑制剂、T4连接酶，dNTP购自promaga公司；质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒、高保真聚合酶，反转录酶、I

3、PTG及引物合成均购自上海生工生物工程有限公司。1.1.3载体，菌株pGEM3z,pQE30,大肠杆菌JM109，M15由本室保存。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据文献报道的neuritincDNA序列设计一对PCR扩增引物正向引物（primer1）：5‘-GGCGGAATTCCGAAAGAGGAGAAATTAACTATGGGACTTAAGTTGAACGGCAGA-3’反向引物(primer2)：5‘-TTGGGGTACCCCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACGGAAGGAAAGCCAGGTCGC-3’primer1的5‘端依次添加了

4、EcoRI酶切位点,SD序列，ATG起始密码子；primer2的5‘端依次添加了Arg和6×His多肽的编码序列，终止密码子TAA，KpnI酶切位点。1.2.2总RNA的提取及RT-PCR断头取鼠脑组织，采用Invitrogen公司的TRIZOL总RNA提取试剂，按我室常规操作进行，以A260nm/A280nm比值及凝胶电泳鉴定其质量，确定其含量。以抽提的RNA为模板，RT-PCR扩增出目的片段，PCR反应参数为94℃2min预变性，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，待反应完毕后，以1.5%琼脂糖电泳鉴定。1.2.

5、3neuritin-pGEM3z重组克隆载体的构建及其鉴定EcoRI、KpnI双酶切PCR靶片段及克隆载体pGEM3z，采用PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，再经T4DNA连接酶连接，连接产物转入JM109感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，进行PCR鉴定筛选，将其具有阳性结果的单菌落进行LB培养基过夜孵育，提取质粒DNA，进行EcoRI、KpnI酶切消化鉴定，送往上海生工生物工程有限公司测序。1.2.4neuritin-pQE30非融合原核表达载体的构建及鉴定根据测序结果，挑选出具有正确的读框的neuritin克隆重组载体，EcoR

6、I、KpnI双酶切neuritin-pGEM3z重组克隆载体与pQE30原核表达载体，分别采用DNA切胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒获得双酶切后的目的片段和pQE30，T4DNA连接酶连接过夜后转化入M15感受态细胞，涂布于含有氨苄和卡那的LB培养基，37℃过夜培养，挑选单菌落进行PCR，EcoRI、KpnI双酶切鉴定阳性转化子。1.2.5重组Neuritin的表达neuritin-pQE30/M15菌株在含有100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜后，以1：100浓度接种于20ml的LB培养基放大培养至OD600

7、为0.6～0.7时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续培养5小时，每隔一小时取1ml菌液，离心收集菌体，加入样品处理液后，电压100V,15％SDS-PAGE电泳3小时，考马斯亮兰染色过夜，脱色液脱色6小时后观察电泳结果。www.100biotech.comservice@100biotech.comArgTAA/KpnIEcorI/RBSKpnIEcorI/RBSneutrtinORFATG6×His3‘5‘6×His(A)(B)EcorIKpnI酶切连接EcorI/RBSArgTAA/KpnI5‘neutrtinORF3‘ATG6×His(C

8、)图1neuritin-pQE30原核重组表达载体构建2结果2.1RNA提取及RT-PCR扩增