分子生物学-根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化

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1、根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化1柑桔材料的准备不同品种的柑桔胚性愈伤组织保存于MT固体培养基上，每20-25d继代一次。侵染前转入悬浮MT（附加100口M乙酰丁香酮）培养基屮培养4天后用于侵染。2农杆菌侵染液的制备1.农杆菌（保存在-70°C）在含有50mg-L卡那霉素的YEB选择培养基上划线培养，28°C暗培养。2.长出菌落后，挑取单菌落在新的选择培养基上涂皿。3.取出培养24小时后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100uM乙酰丁香酮）液体培养基震荡培养2个小时。4.用分光光度计测量菌液的ODgoo值，并用MT液体培养基调整到OD6

2、oo=0.5〜1・0进行侵染。3侵染实验1.将悬浮培养4d的愈伤组织转入稀释菌液中浸泡20-30mino2.用无菌滤纸吸干表面菌液，转到MT基本培养基上，19°C共培养2〜3d。3.共培养后的愈伤组织在无菌水屮轻轻漂洗数次，直至洗液变清为止，再加入含有400mg/L头孑包霉素的无菌水浸泡20min,倾去洗液。4.将外植体置于无菌滤纸上吸干，转入筛选培养基（根据不同的质粒载体添加不同浓度的筛选剂），28°C暗培养。4抗性愈伤组织的选择培养和再生（以质粒载体pCAMBIA1303为例）1.愈伤组织刚传移到筛选培养基上时，应该表现为对照逐渐褐化、死亡

3、，转化处理的愈伤组织中转化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织。2.将新形成的抗性愈伤组织转至新的筛选培养基上进行继代培养，当得到的抗性胚性愈伤组织达到一定量吋，将一部分转入MT+甘油2%+Cef50mg-L1的胚状体分化固体培养基上。3.有球形胚状体开始出现后，将得到的胚状体转入MT+ME1500mg-L1+Cef50mg-L1培养基上，使胚状体进一步长大，形成子叶型胚状体。7・9周后，将子叶型胚状体转入MT+Cef50mg-U1+NAA0.1mg-L'1+BA0.5mg・r+KT0.5mg・r培养基上再生芽，1个月后就可见再生芽长出。当再生芽长到2

4、cm左右时，将其从基部切下转入1/2MT+Cef50mg・「+NAA0.5mg-L'1+IBA0.1mg-L'1+活性炭0.5g・「培养基上生根，也可以通过试管嫁接的办法（见相应方法说明）再生植株。5转化的柑桔材料的PCR鉴定（以g妙基因为例）质粒DNA的小量制备采用碱裂解法。采用CTAB法提取植株DNAog力基因的检测：根据gfp*5基因编码区设计：5'端引物：（5-TGGCCAACACTTGTCACTAC-3）3'端引物：（5-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3）。PCR反应体系为25ul,其中模板0.3-0.5ng,0.2min

5、oldNTP,1.5nunol-L-1Mgcl2,lXTaqDNA聚合酶Buffer,1UTaqDNA聚合酶。循环反应为94°C30s,55°C30s,72°C1min,35个循环。（其中的参数可以根据基因的不同进行适当的调整）6Southern杂交分析：酶切及转膜1.取10也转基因植株DNA,用限制性内切酶EcoFlI（T-DNA内无切点）酶切12h左右。1.取1口1电泳检测酶切结果；若酶切完全后，用0.7%琼脂糖凝胶电泳，0.8-1.OV/cm电泳18~24h°2.将胶切成膜一样大小和形状；用0.2NHCI变性10min,置于转膜台上，用0

6、.4NNaOH作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，转移约24h。3.转好的膜用2xSSC漂洗两次，各5mino用滤纸垫夹，80°C真空烘膜2h以上。4.取出冷却，置于4°C冰箱保存备用。分子杂交1.先将尼龙膜用2xSSC漂洗，凉干后装入杂交炉。2.加入10-20ml(视尼龙膜的数量而定)预热至65°C的预杂交液置于杂交炉中。3.65°C空气恒温摇床预杂交10小时以上。4.探针标记：采用随机引物法。依照不同的尼龙膜数量而采用不同的反应体系。每张膜取100ng探针DNA,加ddHQ至8.0川，100°C变性10min；取出

7、迅速放入冰中冷却10min；然后加入3.0nldNTP(dATP+dTTP+dGTP),引物及缓冲液5.0(11,KlenowFragment酶(1u/

8、jl)1.0(jI；最后在分子杂交炉内加入1.0^1a-32P-dCTP,混匀后置于24°C保温3h以上。5.杂交：在标好的探针中加入600川预杂交液，敝开管盖，100°C干浴变性10min；置于冰上冷却5min；一起加入杂交炉，平放65°C空气恒温摇床杂交6h以上。6.洗膜：杂交完毕后，将膜从杂交筒屮取出，用1xSSC(加有0.2%SDS)室温漂洗1次；然后加预热至65°C的1xSSC洗膜液

9、置于65°C恒温摇床洗1~2次；第一次洗15min,第二次洗的时间依据膜上信号强度而定；洗至膜信号强度为200〜300cpm后，取出摆放到滤纸上晾干。