第十一章 dna文库的构建和目的基因的筛选

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1、第11章DNA文库的构建和目的基因的筛选o基因组DNA文库的构建ocDNA文库的构建o基因克隆的筛选策略oDNA文库的保存基因文库o基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合，像一个没有目录的“基因图书馆”。o某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库（genelibrary）。o基因文库由外源DNA片段、载体和宿主等3个部分组成。1o按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomic

2、DNAlibrary）和cDNA文库（complementaryDNAlibrary）。o常用的文库筛选方法有核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法等。11.1基因组DNA文库的构建11.1.1基因组DNA文库的类型⑴质粒文库o质粒是最早用于构建基因组文库的载体，质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10kb以内。o这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。2⑵噬菌体文库o噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l噬菌体载体、M13单链噬菌体载体、P1噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。

3、oM13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建cDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。o噬菌体文库中应用最广泛的是l噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用l噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用。⑶黏粒文库o黏粒又称柯斯质粒，是由l噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。o黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。o利用它们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组DNA文库等。3⑷人工染色体文库o包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库

4、和P1人工染色体文库，也称为大片段基因组DNA文库，容纳的外源DNA片段为100kb-1Mb。o主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越来越广泛。⑸亚基因组文库o亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。411.1.2文库的代表性和随机性o代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段基因组DNA。代表性是衡量文库质量的一个很

5、重要的指标。o文库构建的两个策略：o部分酶切或随机切割的方法来打断染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段基因组DNA在文库中出现的频率均等；o提高文库所含基因组DNA的总容量，也就是重组克隆的数量，以提高覆盖基因组的倍数。计算公式o为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）式中：N—代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p—表示所期望的目的基因在文库中出现的概率f—表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA总长的比值511.1.3基因组DNA文库的构建流程o

6、构建程序包含：①载体的制备；②高纯度大相对分子质量基因组DNA（highmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。⒈基因组DNA文库的载体制备o载体制备的好坏是影响文库成功与否的关键，制备的载体要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化效果好。o如果载体纯度不高，含有大量细菌基因组DNA，则会出现大量的插入片段为细菌基因组DNA的假阳性菌落。o载体去磷酸化是为了提高连接效率，在同一个连接组分中载体自身连

7、接速度远远大于与外源片段的连接速度。6⒉高质量大相对分子质量基因组DNA的提取和酶切o构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA相对分子质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3-5倍。o大相对分子质量（highmolecularweight,HMW）基因组DNA提取方法一般采用的是在固相环境下对游离的单个细胞进行操作，避免了移液和摇动等造成的剪切力，保护了DNA的完整。利用了低熔点琼脂糖包埋固定的方法。⒊外源DNA的连接转化或包装侵染o存在着至少4种连接方式：载体自连、载体和基因组DNA片段之间的连接、基因组DNA片段的自连和

8、基因组DNA片段之间的连接。o只有载体