目的基因的制备-基因文库法

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1、目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系1目的基因的获取/制备人工合成cDNA文库基因组文库聚合酶链式反应1.基因文库2.cDNA文库3.人工合成4.PCR2基因组文库(genomiclibrary)3分离基因组DNADNA片段与载体连接导入细胞筛选限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装4以l噬菌体制作基因组文库,在一个基因组文库面，所有可能的基因皆被大量复制。利用探针筛选特定基因。5组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA

2、片段的集合.从基因组文库获取目的基因每个细胞含有一个基因组DNA片段与载体的重组DNA分子，许多细胞组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体.genomiclibrary6基因库是通过重组技术转化筛选而建立，利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体，把人类等高等生物的基因或其片段重组其中，成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。7基因组文库的质量评价和完备性基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。如果满足两个

3、条件：生物体染色体DNA片段被全部克隆，用于构建基因文库的DNA片段含有完整的基因，则此基因文库的完备性就是1。用基因组文库的克隆数表示基因组文库的大小即库容量。81.理论值基因组文库的克隆数目（N）＝基因组DNA总长DNA插入片段的平均长度某种生物基因组DNA总长度为3×106kb，酶切后的DNA片段平均长度为15kb，则基因组文库的克隆数应为3×106kb/15kb=2×105个克隆。在实际工作中，由于在基因组文库的构建过程中存在多步操作，一个具备完好代表性的基因组文库的库容量大大超过这个理论值。92.经验值ln(1－f/g)N=ln(1－P)P为从文库中选出任一基因或DNA序列的概率即

4、完备性，一般设为99％（0.99）；f为载体容量（kb）；g为基因组大小（kb）；N为基因组文库的克隆总数，表示文库中以P概率出现某段DNA,理论上应具有的最少克隆数；10人单倍体DNA总长为3×109bp若载体装载量为15kb则构建完备性为0.9的基因组文库大约需要个重组克隆.完备性0.990.9990.999946万库容量92万138万184万?11表几种典型生物基因组文库大小与载体容量的关系种类基因组（bp）10kb（质粒）25kb（噬菌体）45kb（粘粒）理论值经验值理论值经验值理论值经验值大肠杆菌4.6×1064602116184845102468酿酒酵母1.8×107180082

5、8772033134001840水稻5.7×10857000262492228001049961266758330人3.2×10932000014736521280005894597111132747612选择载体的主要参数是基因组大小构建大肠杆菌（4.6×106bp）等基因组较小生物的基因组文库时，按每个DNA片段平均长5kb计算，一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列，采用质粒作为载体便可得到满意的结果。构建较大基因组的文库时，噬菌体、粘粒及YAC常选作克隆载体。基因组文库分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、

6、酵母人工染色体文库等）。13可获得的基因HGP对比分析内含子、外显子及调控区域基因原始结构功能的研究应用范围该种生物所有基因◆◆◆14cDNA文库(cDNAlibrary)15逆转录mRNADNA以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。16逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA双链DNA逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。17逆转录酶的应用:应用于基因工程基因mRNA蛋白质多肽链18尿素-氯化锂法硫氰酸胍法polyT亲和层析法密度梯度离心分级法探针筛选法mRNA的提取与纯化19polyT亲和层析法AAAAA

7、AAAAAAApolyTpolyTpolyT20基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNA文库的组建1.mRNA提取2.cDNA合成cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成3.双链cDNA的分子克隆4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖.21mRNA分离纯化反转录合成cDNA构建cDNA文库筛选目的基因22反转录合成单链cDNA23置换合成法合成cDNA第二链24引物-衔接头法合成cDNA第二链