基因工程基因文库的构建

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1、第六部分基因文库的构建一、基因文库的概述二、基因组DNA文库的构建三、cDNA文库的构建1、基因文库(genelibrary)概念是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。一、基因文库的概述2、基因文库的分类基因组DNA：提取的染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序

2、列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。cDNA：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推导出来。基因组文库（genomiclibrary）含有全部基因。cDNA文库（cDNAlibrary）含有全部蛋白质编码的结构基因。用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA。用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA。在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种

3、生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。(1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。基因组文库根据DNA来源分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库、线粒体基因组文库。

4、克隆外源DNA片段的切割主要采用机械断裂或限制性部分酶解两种方法，其基本原则：①DNA片段之间存在部分重叠序列。②DNA片段大小均一。(2)cDNA文库(cDNAlibrary)：是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。基因组文库与cDNA文库的最大区别：基因组文库含有而cDNA文库不含有

5、非转录的基因组序列。2021/10/463、构建基因文库的基本方法将特定生物体的因组DNA或cDNA分解成适当大小的DNA片段,然后分别与克隆载体连接成重组DNA分子。通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。二、基因组文库的构建(一)基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。(二)基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文

6、库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)（三）基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。※(四)基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备。②高纯度、大分子量基

7、因组DNA的提取。③基因组DNA的部分酶切与分级分离。④载体与DNA片段的连接。⑤转化或侵染宿主细胞。⑥筛选鉴定基因组及保存。①载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或l-DNA上述几种载体的最大装载量如下：用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌②基因组DNA的制备为了最大限度保

8、证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3－5倍），文库的重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得>100kb大小的DNA片段。AAAA③基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：①保证DNA片段之间