第六章：基因文库的构建

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1、第六章：基因文库的构建高燕会主要内容：1、基因组文库2、cDNA文库3、特殊序列文库4、酵母人工染色体（PAC）基因文库就是随机克隆的集合。基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。通常所说的基因文库包括基因组文库和cDNA文库，两种文库构建的基本程序相同，主要包括载体的制备、插入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组DNA分子导入宿主菌。根据核酸来源不同：基因文库分为基因组文库是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。cDNA文库是利

2、用从RNA序列反转录形成的cDNA序列构建的。此外:特殊序列文库是针对某些特殊基因或序列而建立的。构建文库所使用的载体主要有：λ噬菌体(噬菌斑)粘粒(菌落)质粒酵母人工染色体(构建高等真核生物基因文库设计)根据所用载体的不同：质粒文库噬菌体文库粘粒文库YAC文库质粒文库：其构建过程相对简单，但载体装载外源DNA的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和克隆数不多的cDNA文库的构建。、粘粒文库和噬菌体文库：其装载容量较大，克隆效率较高，是目前构建基因组文库和cDNA文库最为常用的载体。YAC载体能够容

3、纳长达1Mb的外源DNA，主要用于超长DNA片段的克隆，第一节：基因组文库（GenomicLibraries）指把某种细胞的整个基因组DNA，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一大批含有重组体DNA分子的细胞克隆群体。即：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和建立基因组文库，取决于两项技术系统一是具有包装能力的载体系统，二是离体包装系统。（1）载体系统具有包装能力的载体系统主要有两类：λ噬菌体和粘粒A．λ噬菌体载体插入型载体，只有一

4、个可供外源DNA插入的酶切位点。取代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的DNA片段可以被外源DNA取代。取代型载体应用最广泛如λEMBL1-4是一类取代型载体系列B．粘粒粘粒作为载体的特点是：一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNA，有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的颗粒。然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。质粒＋噬菌体（2）离体包装系统A．对带有外源DNA的杂合分子有直接筛选和富集的作用

5、。B．提高重组DNA分子产生克隆的频率离体包装系统由两种具有突变的溶源化的大肠杆菌组成。溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。δ基因组文库的规模N—基因组文库克隆总数P—所需机率N=f—插入片段与基因组DNA长度之比Δ建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段完全酶切ln（1-P）ln（1-f）3.供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连

6、接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。第二节、cDNA文库定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成c

7、DNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。1.基因特异性常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA2.器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同1、cDNA文库的特点4.不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝

8、基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5.各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同2、cDNA文库(1)原理：RNAcDNA克隆真核基因：内含子和特定的调控结构采用构建cDNA文库是为了对某些真核基因进行研究N=f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA(mRNA）分子数目之比ln(1―p)ln(1―f)3、cDNA文库的规模4、建立cDNA文库的一般程序1