基因文库构建的过程

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1、基因文库构建的过程、原理及方法2011-07-1909:53转载自分享最终编辑robertoyuanFrom:http://blog.sina.com.cn/s/blog_4c7fd9c8010008cx.html1cDNA文库的构建1.1cDNA文库构建的基本原理与方法cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基

2、本步骤包括：RNA的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA后，用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链，cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的

3、修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。1.2cDNA全长文库经典cDNA文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA全长，建立富含全长的cDNA文库具有重要意义。

4、为此，必须克服仅用mRNA的PolyA尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA文库，是指从生物体内一套完整的mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体，是mRNA分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅能提供完整的mRNA信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH公司的SMARTcDNALibraryConstructionKit方法或GeneRacer试剂盒(I

5、nvitrogen，USA)使用说明进行。判断一个cDNA文库中的cDNA序列是否是全长基因的cDNA，主要方法有以下几种。1.2.1直接从序列上评价5'端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因5'末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个ATG上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5'帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是cDNA5'序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端：同样可以

6、用其它生物已知的对应基因3'末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的PolyA加尾信号，或无明显加尾信号的则也有PolyA尾。1.2.2用实验方法证实可以通过引物延伸法确定5'端和3'端的长度，如：5'端RACE，3'端RACE，或者通过NorthernBlot证实大小是否一致。1.3对cDNA文库的分析对cDNA文库质量的评价主要有两个方面。第一方面为文库的代表性，cDNA文库的代表性是指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表

7、性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始cDNA文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度mRNA是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。满足最低要求的cDNA文库的库容量可以用Clack-Carbor公式N=Ln(1-P)/(1-1/n)计算(P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99％；N为文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理

8、论上应具有的最少重组子克隆数；n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数；T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数)。第二方面是重组cDNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但