第11章 dna文库的构建和目标基因的筛选

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1、第十一章DNA文库的构建和目标基因的筛选第一节基因组DNA文库的构建第二节cDNA基因文库的构建第三节基因克隆的筛选策略第四节DNA文库的保存基因库(genepool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在)基因文库(genelibrary)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。cDNA文库：材料来自

2、mRNA，含有全部蛋白编码基因的cDNA，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的cDNA文库依研究目标而定。西南大学生物技术专业基因工程3第一节基因组DNA文库的构建一、基因组DNA文库的类型和发展1、质粒文库：容纳片段小于15kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：一般用λ载体，插

3、入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ文库略长，达45kb左右。4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)、酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)、P1人工染色体(P1artificialchromosome,PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱

4、构建。西南大学生物技术专业基因工程45、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、PFGC特定片段回收、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。6、基因组文库的发展：略二、文库的代表性和随机性代表性意味着文库要有完备性，是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)。其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。例：人的单倍体DNA总长为3.2x109bp，假如文库中

5、克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。随机性既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆

6、；5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。1、基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右。AAAA如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段三、基因组DNA文库的构建流程超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工

7、接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。2、基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。3、载体和受体的选择与制备出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。由于

8、绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。几种载体的最