文库的构建和筛选课件

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1、第五章cDNA文库的构建和筛选将RNA转变成cDNA以及cDNA文库构建cDNA文库筛选策略cDNA表达文库的功能筛选用cDNA检测基因的表达体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因细胞中总RNA•信使RNA(mRNA):1-5%.作为蛋白质合成的模板。•核糖体RNA(rRNA):>80%.构成核糖体，参与蛋白质翻译•转运RNA(tRNA):10-15%.将mRNA中的信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异性。因此，mRNA对于了解细胞中的信息流非常重要.•Size–examinedifferentialsplic

2、ing（检测可变剪接）•Sequence–预测蛋白产物•Abundance–检测表达水平•Dynamicsofexpression–不同的时间、发育阶段和组织的特异性。mRNA特点第一节：将mRNA转变成cDNAcDNA：与mRNA互补的DNA，称为cDNA。由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库，称之为cDNA文库Ribonucleases(RNases)•RNasesarenaturallyoccurringenzymesthatdegradeRNA•Commonlaboratorycontaminant

3、(frombacterialandhumansources)•AlsoreleasedfromcellularcompartmentsduringisolationofRNAfrombiologicalsamples•CanbedifficulttoinactivateRNA分离•TotalRNAfrombiologicalsamples–Organicextraction–Affinitypurification•mRNAfromtotalRNA–Oligo(dT)resins•mRNAfrombiologicalsamples–Oligo(dT

4、)resinsSchooloflifesciencesNantongUniversityRNA分离从生物体内分离totalRNA（有机分离法）Lyse/homogenizecells加入酚:氯仿:异戊醇到裂解细胞中并离心Organicphaseseparatesfromaqueousphase•有机相在底层•水相在上层(containstotalRNA)•洗白破碎物以及大片段的基因组DNA在两相界面吸取上清至新管乙醇沉淀RNA并用水重新溶解用层析柱分离总RNALysecells,andspintoremovelargeparticulates/ce

5、lldebrisApplylysate(containingnucleicacidsandcellularcontaminants)tocolumnwithglassmembrane用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质从侄子中流出。用DNase处理污染的DNAApplywatertothecolumn;purifiedRNAwashesofftheglassandiscollectedSchooloflifesciencesNantongUniversity•mRNA的3’末端具有polyA尾巴•Oligo(dT)探针用于分离总RNA中的mR

6、NA•mRNAcanbeelutedfromoligo(dT)matrixusingwaterorlow-saltbufferMessengerRNAIsolationMessengerRNAIsolation二、cDNA的合成A、用polyT作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物第一节：将mRNA转变成cDNAB、基因特异的引物C、随机引物第一节：将mRNA转变成cDNA在构建cDNA文库之前，需要将单链cDN

7、A合成双链，主要有以下二种种方法：A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA，cDNA第一链3’端回折充当引物，形成第二链mRNAcDNAAAAAAAAAATTTTTTTTTB、用来自E.coli中的RNaseH降解的RNA充当引物，在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成第二链DNA第一节：将mRNA转变成cDNAmRNAcDNATTTTTTTTTcDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNA文库的特点cDNA文库代表了某个器官或组织中的RNA群体。在某个给定的cDNA文库中某些表达丰富的mRNAs的克隆数目比较多，在文库中也有少数的克隆

8、代表稀少mRNAs如果某个基因有多种拼接方式，在文库中也有代表该基因不同拼接方式的克隆。第一节：将mRNA转变成cDNA三