《I基因文库与筛选》PPT课件

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1、南京林业大学对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。目的基因：已知基因：未知基因：构建基因文库特定探针的制备文库的

2、筛选（筛库）含目的基因的克隆南京林业大学南京林业大学南京林业大学南京林业大学基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作丧失其中的基因或某些序列。构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列(代表性文库)?如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆，这样的文库就不具代表。同样如果文库中未能含有足量的克隆，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的cDNA文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含mRNA起始材料的具代表性的文库。具有代表性的基因组文库南京林业大学只有当此文库中重组子总数达到某一

3、值时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。所需重组子数目主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小。1975年，Clarke和Carbon提出了一个计算这一重组子数目的公式。N=ln(1-P)/ln(1-f)N为所需的重组子的数目；f为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比；P为选出某一基因的概率(通常期望为99%)。南京林业大学南京林业大学I1-4载体对于某一特定的基因组，构成其DNA文库所需的重组子的数目，在很大程度上与构建文库所用的载体的容量紧密相关。质粒、噬菌体、粘粒、BAC或酵母人工染色体等载体都可被用来构建基因组文库，选用哪种载体取决于基因组的大小。这

4、些载体所能插入的片段大小的上限分别依次为10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA连接酶将基因组DNA片段与制备好的载体分子相连接。附：原核生物基因组DNA文库的构建（一）原核生物基因组DNA的提取染色体DNA质粒DNA要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂（二）基因组DNA的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶a)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256b)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/10242、分离目的酶切片段大小的确定a)克隆单个基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、DNA不完全酶切条件的确定a)确

5、定限制酶用量，改变酶切时间b)固定酶切时间，改变限制酶的用量（三）酶切片段与克隆载体连接１、酶切片段的分离与纯化１）低熔点琼脂糖回收目的片段２）试剂盒回收目的片段2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择a）质粒载体可承载15kbDNA左右片段(有效的范围为<10kb)b）载体可承载25kbDNA左右片段(有效的范围为15kb)c）Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段(有效的范围为<40kb)（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现

6、互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌２、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation)2）转导法(transduction)3）转染法(transfection)（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选1、基因组DNA文库的保存1)影印膜滤保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC

7、储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大南京林业大学通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备