第六章：目的基因筛选与dna文库构建

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1、第六章目的基因筛选与DNA文库的构建目的基因的获得基因文库（genelibrary）；从物种的基因组或cDNA中PCR扩增；人工合成基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因基因文库（Genelibrary）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。即Genomiclibrary基因组DNA文库：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。按照外源DNA的片段：基因组DNA文

2、库和cDNA文库包含基因的全部信息，如编码区，非编码区，内含子和外显子、启动子及调控序列cDNA文库:complementaryDNA互补DNA由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库。反映了基因表达普，对研究基因表达，调控及基因互作非常有用。基因组DNA文库的构建程序：1、载体的制备；2、高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；3、HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；4、载体与外源片段的连接与转化或侵

3、染宿主细胞；5、重组克隆的挑取和保存。构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。文库的代表性和随机性代表性文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。采用酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；增加文库总容量。外源片段大小和重组克隆数量1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率

4、f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值哺乳动物3×109kb若p=99%平均克隆片段20kbf=20kb/3×109n=690773.2E.coli4，639，221bpp=99%f=20kb/4600kbn=1056.9p=99%f=10kb/4600kbn=2116一、用于构建基因文库的载体第一节基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPlasmid<10kbPhage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kbYAC~300kb-1.2Mb粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个。噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装

5、效率高和杂交筛选背景低的优点；经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段。YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC可减少DNA分子间的重组置换型载体coscosRLCentralstuffer1．phagevectors目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon38-40，GEM-11等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb有利于分子杂交进行筛选43kb，左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。克隆DNA片段的大小为9-23kb。2．Cosmidvector（柯斯质粒）由噬菌体的cos序列

6、、质粒的复制序列及抗生素抗性基因所有cosmidvector均可用于构建文库。cos序列：噬菌体DNA的包装序列T4噬菌体DNA连接酶多连体分子二、用phage构建文库1．总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb（cosmid200kb）2．载体臂的制备·购买·载体制备、纯化·限制酶消化BamHI/EMBLXhoI/GEM-11·载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖或NaCl）梯度离心的收获量大，而agarose回收量小回收无填充片段聚乙二醇沉淀，除去碎片置换型载体coscosRLCentralstuffer3．基因组DNA的

7、消化一般采用Sau3AI消化回收20-24kb（agarose法or梯度离心）·有些载体可做不完全补平4．连接/包装连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4℃6个月稳定）5．扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6．在宿主菌上形成噬菌斑7．带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8．对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析载体的去磷酸