小麦不同部位蛋白全程研究过程简介

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1、小麦不同部位蛋白全程研究过程简介1.1小麦叶片蛋白质组提取采用TCA／丙酮沉淀一酚／SDS联合抽提法来提取小麦叶片蛋白。参照Wang等[1]方法，加以改进。取新鲜的小麦叶片1g，液氮中迅速研磨成细粉，加入10mI于一20℃预冷的提取介质[10TCA(w／V)丙酮溶液+0．2DTT]，反复颠倒混合，一20℃沉淀2h或过夜；4℃，16000×g离心10min，弃上清；沉淀用含100mmol／I醋酸铵的80甲醇溶液洗1次，80丙酮洗1次，通风橱内室温干燥10min；加入10mI酚／SDS抽提夜[-pH8．0Tris饱和酚与SDS缓冲液(30蔗糖、2SDS、5J3一巯基乙醇

2、、0．1mol／[pH8．0Tris—Hc1)1：1}昆合]振荡混匀温育5min，4℃，16000×g离心10min，转移上层酚相至一干净新管中，加入5倍体积的冷的含100mmol／I醋酸铵的甲醇溶液，一20℃沉淀4h或过夜；4℃，16000×g离心lOmin，弃上清液，沉淀用甲醇洗1次，80丙酮洗1次，通风橱内自然风干，～80℃冰箱保存备用。1.2小麦胚乳蛋白的提取赵[2]选用TCA-丙酮法，抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后10d取挂牌标记的5个穗，取穗中上部灌浆一致的籽粒，剥去颖壳置于冻存管中-80℃保存。取冻存籽粒20粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵

3、中迅速剥去种皮，切去胚，加0.2%PVP迅速研磨至糊状，悬浮于含0.07%DTT的预冷10%TCA-丙酮，-20℃过夜。次日4℃35000r·min-1离心15min，弃上清，将沉淀重悬于80%丙酮，于-20℃温浴lh，4℃16000r·min-1离心15min。沉淀重悬于100%丙酮，于-20℃温浴lh，4℃16000r·min-1离心15min。重复此步骤2~4次，倒出上清液，离心管置于冰浴中抽真空15min至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。1.双向电泳技术1.1小麦叶片蛋白质组双向电泳技术参照李[3]采用SDS—PAGE和双向凝胶电泳30mg蛋白粉加入300

4、FI水化上样缓冲液(8mol／I尿素、4CHAPS、65mmol／IDTT、0．2V／VBioIyte)，37℃水浴30min，6℃，40000×g离心30rain，取上清液，Bradford法测定蛋白浓度。SDS—PAGE电泳上样量为100mg，蛋白样品与2×电泳上样缓冲液等体积混合，直接在12的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，胶体考染口，用普通凝胶成像系统(Bio—Rad，美国)采集图像。双向电泳采用BioRad公司电泳系统(ProteanIEFcell等电聚焦系统、PR()TEAN11xiCell垂直电泳系统、Minipro—teanⅢcell垂直电泳系统)，蛋白上样量

5、为：7cm胶条200Fg、17cm胶条5OOFg。等电聚焦和向第二向SDS—PAGE的转移参照Bio—Rad操作指南进行。IPG胶条为7、17cm(pH值3～10、4～7，Bio—Rad)，第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为12。染色采用胶体考马斯亮蓝染色方法l1。UMAXPower—I．ook2100XI型光密度扫描仪(Bio—Rad，美国)，分辨率设为300dpi采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行3次重复。PDQuest7．4软件(BioRad，美国)对图像进行分析。2.2小麦胚乳蛋白的双向电泳对小麦胚乳采用以下技术进行电泳如赵[4].样品被动上样及等电聚焦

6、,选用17cmIPG胶条（pH4~7）。IPG干胶条胶面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝水，被动水化14h后，置于Bio-Rad等电聚焦仪中，等电聚焦在20℃条件下自动进行，每胶条限流50μA。等电聚焦参数如下：①500V4h除盐；②1000V1h线性上升（Gra）；③8000V2.5h线性上升（Gra）；④8000V0.5h聚焦。胶条的平衡,将等电聚胶后的胶条胶面向上置于5mL平衡缓冲液Ⅰ（50mol·L-1Tris-HCL，pH8.8，6mol·L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝，1%D

7、TT）中平衡摇床震荡15min，然后再置于5mL平衡缓冲液Ⅱ（50mmol·L-1Tris-HCL，pH8.8，6mol·L-urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝，2.5%碘乙酰胺）中平衡15min，取出后放在湿润的定性滤纸上，以吸去表面多余的液体。SDS-PAGE,采用Bio-Rad垂直电泳系统，胶的浓度为12%，将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面上，用0.5%的低熔点琼脂糖封顶液封闭排除气泡。在电泳槽中加入约1.5L电泳缓冲液（0.025mol·L-1Tris，0.192mol·L-1Glyeine，0.1%SDS）第一步每块胶1