重组DNA技术20110413分子生物学

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1、重组DNA技术(DNA克隆或分子克隆)DNARecombinationTechnique(DNACloningorMolecularClone)第二章1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌重组DNA技术的发展史O.T.Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA；1953年,Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型1958年,Meselson和Stahl证实了DNA的半保留复制同年，Crick提出遗传信息传

2、递的“中心法则”1961年，F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型1966年，Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码1972年，P.Berg等率先完成DNA体外重组(诺贝尔化学奖)1973年，S.Cohen等进一步实现了重组DNA的转化1977年美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年，第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1982年，美国FDA批准首例基因工程产品--人胰岛素1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg---50万只羊脑基因

3、工程9升大肠杆菌培养液相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系主要内容：第一节、重组DNA技术相关概念ConceptAssociatedtoRecombinantDNATechnology克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组D

4、NA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinantDNA,chimeraDNA），即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNAcloning）。DNA克隆生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学或重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)，基因操作(genemanipulation)、遗传工程(genedceng

5、ineering)。(二)目的基因进行DNA重组的目的主要有两方面：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(targetDNA)。目的基因有两种类型：cDNA(complementaryDNA):在体外经反转录合成的．与mRNA互补的DNA。基因组DNA(GenomicDNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。(三)载体一.表达载体(expressionvector):为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。二.克隆载体(Cloningvector):为使插入的外源

6、DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。第二节重组DNA技术操作的基本过程基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体细胞筛筛选重组体目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线以质粒为载体的DNA克隆过程第三节重要的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段

7、连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末