人卫8版-DNA重组及重组DNA技术

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1、生物化学与分子生物学DNA重组和重组DNA技术DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重组（DNArecombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNatureDNA重组同源

2、重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)转座重组(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.

3、coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型一、同源重组是最基本的DNA重组方式Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本

4、DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支

5、迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片

6、段重组体拼接重组体二、位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。（一）λ噬菌体DNA的整合（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两

7、个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生

8、在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶