重组DNA技术-II

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1、四、克隆DNA的分析AnalysisofClonedDNA基本分析方法GeneralAnalysisMethod酶切分析—确定插入片段的方向及大小序列分析—确定插入片段的核苷酸序列杂交分析—确定插入片段的同源性蛋白质分析—确定所得基因的真实性结构-功能分析重组质粒的鉴定IdentificationofRecombinantPlasmid连接反应物转化宿主菌涂布于含相应抗菌素的LB/agar平板(粗筛)带质粒的菌筛选重组子鉴定重组子筛选重组子方法GeneralMethodsforRecombinantScreening1）互补—通过插入失活lacZ基因，破坏重组子与宿主间的互补作用。载体

2、携带一段编码--半乳糖苷酶--肽的DNA序列，可与宿主细胞(基因型为lacZM15)编码的--半乳糖苷酶C端肽产生互补而形成有活性的--半乳糖苷酶，在有生色底物X-gal的抗性平板上蓝色菌落。外源DNA的插入使--肽基因失活，从而不能形成互补，表现为白色菌落。2）插入失活—载体须带有双抗标记如pBR322载体具有Tcr+Ampr，外源DNA插入Tc抗性基因后，表现为TcsAmpr，可用分别含Tc+Amp和Amp的平板对照筛选重组子。3）环丝氨酸(cSer)致死筛选—只适合插入失活抗Tc基因的重组子筛选如pBR322中Tc失活后，在含Tc和cSer的培养液中生长受抑制，故cS

3、er不能掺入，宿主菌不死。而转化有载体本身的细菌可在该培养液中生长，同时掺入cSer导致宿主菌死亡。4）插入表达筛选如pTR262载体的Tcr基因上游有CI基因的负调控序列，可抑制Tcr基因的表达，故不能在Tc平板上生长；外源DNA的插入使该序列失活而解除对Tc抗性基因表达的抑制，表现为Tc抗性菌落。1）电泳鉴定—初步判断是否有插入片段存在挑取单菌落培养后，小规模制备质粒。然后以载体DNA为对照直接进行琼脂糖凝胶电泳。前提：插入片段较大2）酶切分析—判定插入片段大小和方向；制作DNA的限制酶图谱提取质粒DNA，进行单或双酶切分析。电泳时需同时跑DNA大小标准物(DNAMarker)。插入处

4、酶切位点保留插入处酶切位点消失确定插入方向限制酶图谱制作鉴定重组子方法鉴定重组子方法3）核酸序列测定DNA序列分析—化学法和酶学法RNA序列分析—用可在特定核苷酸的3‘端切割RNA分子的一套四种RNase被用来消化5‘末端标记的RNA分子，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定序列。T1-GU2-APhyM-A与UBacilluscereusRNase-U和C确定DNA插入方向EcoRIBamHIEcoRIBamHI限制酶图谱制作示范AnExampleofMakinganREMapHowmanysitesforE1?HowmanysitesforE2?WhatistherelationshipbtwE

5、1&E2?限制酶图谱制作示范AnExampleofMakinganREMap2.DNA序列测定DNASequencing(１)Sanger酶学法模板：ssDNA或dsDNA。后者需经热或碱变性质量：ssDNA好于dsDNA引物：与模板序列互补的寡核苷酸底物：dNTP+dA*TP+ddATP/ddGTP/ddCTP/ddTTPdA*TP:32P、33P或35S酶：T7SequenaseVersion2.0DNAPolymeraseTaqDNAPolymerase产物：有固定的起点，但随机终止于某一特定的核苷酸分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳对凝胶中压缩条带的处理：i.dNTP类似物，如dITP或7-

6、脱氮-dGTPii.测定另一条链的序列序列测定的原理SequencingPrinciple1.DNA聚合酶可在模板的指导下，从引物的3‘端掺入dNTP进行延伸反应；2.双脱氧核苷酸(ddNTP)可作为DNA聚合酶的底物掺入新生链中，但不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，此时链延伸终止；3.控制ddNTP与dNTP的比例，可使链延伸在与所加ddNTP种类相应的位置随机终止，从而产生一系列长短不一、末端带同一残基的核苷酸链；4.如同时进行四套反应，且每套反应中分别加入一种ddNTP，结果将产生4组核苷酸链，分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。模板与引物退火Annealingofte

7、mplateandprimer反应管中加入ddATP(ReactioninthepresenceofddATP)聚丙烯酰胺凝胶电泳RunningPolyacrylamideGelTCCGCGTTTTAAGGCTGCGGATATAGG5’Sequencing测序策略根据待测序列的长度、性质，所要求的测序精确度及现有的设施来制定测序总策略。1）确证性测序用处：鉴定突变体；确定插入片段方向引物位置：设计引物，使其位置在距待测D