分子生物学8DNA重组技术liu.ppt

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1、第八章基因重组与基因工程基因工程：按人为的设计，通过基因克隆技术有目的地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程称为基因工程（geneticengineering）。基因工程就是要改造DNA,涉及DNA序列的重新组合和建造,其核心即是人工的DNA重组。DNA重组：不同来源的DNA分子通过末端共价连接形成重新组合的DNA分子的过程称为DNA重组（DNArecombination）。基因克隆（DNA克隆）：是指在体外对DNA分子按照既定的目的分离、剪切和重新连接，构成重组的DNA分子，然后把它导入宿主细胞，使其在宿主细胞内扩增，从而获得该DNA分子的大量拷贝。由于此克隆技术是

2、在分子水平上进行的，故又称为分子克隆（molecularcloning）。基因工程、蛋白质工程、酶工程共同构成当代新兴的学科领域——生物技术工程。第一节工具酶限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases）DNA连接酶（DNAligase）DNA聚合酶（DNApolymerase）末端脱氧核苷腺转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）一、限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases）又称限制性内切酶，简称为限制酶，能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。5’AACGT

3、TCGAAGCTTTAGGCCCGAT3’(一)限制酶的命名与分类限制酶常以4个字母命名，第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、三个字母是细菌的种名，用小写；第四个字母代表株名。另外用罗马字代表同一菌株中不同限制酶的编号。如HindⅢ的H代表Haemophilus属，in代表influenzae种，d代表Rd菌株，Ⅲ代表该菌株中第三个被分离到的限制酶。限制性核酸内切酶分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型，基因克隆中所用的限制酶是Ⅱ型酶。(二)Ⅱ型限制酶的识别和切割位点Ⅱ型酶的识别序列通常为4～6bp，具有回文结构（palindrom），大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′或3

4、′末端突出的粘性末端（stickyend）。如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；5′－G↓AATTC－3′5′－G5′AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAA5′G－5′PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：5′－CTGCA↓G－3′5′－CTGCAG－3′3′－G↑ACGTC－5′3′－GACGTC－5′还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（bluntend）。如SmaI:5′－CCC↓GGG－3′5′－CCCGGG－3′3′－GGG↑CCC－5′3′－GGGCCC－5′有些限制酶识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性

5、末端，这些酶称为同尾酶（isoaudamers），如BamHI（G↓GATCC）和Sau3AI（N↓GATCN）。由此产生的粘性末端称为配伍末端（compatibleend），可进行相互连接，在DNA重组中具有更大灵活性。二、其他工具酶1.DNA连接酶（DNAligase）：催化DNA片段之间的3’-5’磷酸二酯键的形成。2.DNA聚合酶：基因克隆中常用的DNA聚合酶有大肠干菌DNA聚合酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶。3.末端脱氧核苷腺转移酶：将dNTP逐一加到DNA的3’-OH上。三、目的基因在基因工程中，欲要克隆的基因或要表达的基因称为目的基因，又称为目的

6、DNA（targetDNA）。包括cDNA和基因组DNA(genomicDNA)。第二节基因载体外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要将外源DNA与某种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插入外源DNA片段构建重组DNA分子，并将外源DNA携带进入宿主细胞并进行复制的DNA称为基因克隆载体，简称为载体（vector）。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。一、质粒（一）质粒D

7、NA的生物学特性①质粒（plasmid）是一些染色体外的环形双链DNA分子；②质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，大小从1kb至200kb不等；③具有自主复制能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。④由质粒产生的表型含有对抗生素的抗性基因，可供筛选用。⑤有共价闭环DNA、开环DNA、线状DNA三种存在形式（二）良好载体应具备的条件分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较多的拷贝数；具有可供选择的遗传标志，便于对宿主细胞进行识别和筛选，如抗生素的抗性基因、lacZ’等；带有尽可能多的限制酶单一酶切位点，即多克隆位点（multi