基因重组与分子生物学技术

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1、第八章基因重组与分子生物学技术一、基因重组技术1．基因重组技术的概念2．基因重组技术基本原理3．基因重组技术与医学的关系二、分子生物学常用技术1.核酸分子杂交与探针技术2.分子印迹技术3.聚合酶链反应技术4.DNA序列分析技术学习要点：第一节基因重组技术重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆(molecularcloning)。基因重组(generecombination):DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。基因工程(gene

2、ticengineering）:采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。相关实验：1964年Gurdon等进行的非洲爪蟾实验1970年Steward等用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成可育的胡萝卜植株。1997年英国学者克隆出“多莉”羊一、基因重组基本过程①载体和目的基因的分离；②载体和目的基因的切断；③载体和目的基因的重组(接)；④重组DNA的转化和扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。VectorTargetDNARecombinantplasmid/DNAClone(一)D

3、NA重组技术中最常用的工具酶酶类主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶I①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3’末端④DNA序列分析耐热DNA聚合酶（TaqDNApol等）聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段二、工具酶（二）限制性核酸内切酶作用特点①产生5’突出粘性末端(cohesiveend):以EcoRI为例：5’…G↓AATTC…3’→5’…G  -pTTAAC…3’3’…CTTAA↑G…5’→3'…CTTAAp- OHG…5'②产生3’

4、突出的粘性末端：以PstⅠ为例：5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAOH- pG…3’3’…G↑ACGTC…5’→3’…Gp- OHACGTC…5③产生平末端(bluntend):NruⅠ为例：5’…GTT↓AAC…3’→5’…GTTOH-pAAC…3’3’…CAA↑TTG…5’→3’…CAAp-OHTTG…5’限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)在重组DNA技术中有重要地位限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因

5、工程提供有力工具。配伍末端：识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端。三、载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。1．质粒是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因

6、，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。质粒pUC19的分子结构2．噬菌体可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。3．病毒常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要

7、有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。④容易从宿主细胞中分离纯化出来。⑤有容易被识别筛选的标志。第二节基因工程操作步骤一、目的基因的获得目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2．人工合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶

8、催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。4．从基因文库中筛选将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(geno