DNA重组技术与基因操作

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1、第二章DNA重组技术与基本操作限制性内切酶克隆载体重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法DNA重组技术要有四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞DNA限制性内切酶可分为三类：Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅡ类限制性内切酶是基因工程中所用的主要工具酶Ⅰ、Ⅲ限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。Ⅰ类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。Ⅰ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用第一节限制

2、性内切酶一、II类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点，产生出特定的酶切末端→5’突出粘末端、3’突出粘末端、平末端；Ⅱ类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。5’突出粘性末端EcoRI的识别序列为3’突出粘性末端PstⅠ识别位点平端SmaⅠ识别位点5’GAATTC3’3’CTTAAG5’切割5’-G-CTTAAAATTC-3’G-5’+5‘CTGCAG3’3’GACGTC5’5’-

3、CTGCA3’-GG-3’ACGTC-5’+5’CCCGGG3’GGGCCC5’CCCGGGGGG3’CCC+二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注

4、意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生staractivity的原因。staractivity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度>12％；酶：DNA比率>25u/μg；缺少Nacl和存在Mn2＋。4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在20μl反应体积中，37℃，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCⅠ在5小时内具有全部活力BamHⅠ

5、在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。CfoⅠ仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。→这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段

6、（klenowfragment）、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在invitro条件，合成单链RNA作为杂交探针。3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的γ－磷酸基转移至DNA或RNA片段的5’末端。用途：标记DNA片段的5’端 ，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于测序引物的5’标记。5’HOOH3’HOOH3’5’5’突

7、出末端5’隐蔽末端5’32POH3’HO32P3’5’γ32PATP4、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5’末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用［γ－32p］ATP标记DNA或RNA的5’末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5’磷酸。5’POH3’HOP3’5’5’突出末端5’隐蔽末端OHHO5’HOOH3’3’5’第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后

8、的外源DNA片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码