DNA重组技术与基因操作1

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1、第三章动物基因工程基础限制性内切酶克隆载体重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法基因工程研究的理论依据不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代DNA重组技术要有四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞DNA限制性内切酶可分为三类：Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅠ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用,why?第一节限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制

2、性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。Ⅰ、Ⅲ限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份2种不同的亚基切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp

3、的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割能能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大一、II类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点，产生出特定的酶切末端→5’突出粘末端、3’突出粘末端、平末端；Ⅱ类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。被限

4、制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做粘性末端。EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段SmaⅠ特异识别CCCGGG,形成平末端5’CCCGGG3’GGGCCC5’CCCGGGGGG3’CCC＋二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注

5、意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生staractivity的原因。staractivity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度>12％；酶：DNA比率>25u/μg；缺少Nacl和存在Mn2＋。4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在20μl反应体积中，37℃，每小时

6、水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCⅠ在5小时内具有全部活力BamHⅠ在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。CfoⅠ仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。→这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提

7、高连接效率。DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I：3种催化活性klenow大片段酶：2种催化活性T4噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性T7噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）反转录酶：3种催化活性末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在invitro条件，合成单链RNA作为杂交探针3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的γ－磷酸基转移至DNA或RNA片段

8、的5’末端。用途：标记DNA片段的5’端 ，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于测序引物的5’标记。5’HOOH3’HOOH3’5’5’突出末端5’隐蔽末端5’32PO